以葡萄糖为唯一碳源合成聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)的研究

摘要

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类微生物在胞内积累的碳源和能源储存物质,具有生物可降解性、热可塑性,生物相容性,光学活性,和压电特性等。因此,PHA作为生物可降解塑料被认为是解决由大量废弃塑料造成的环境污染问题的希望,而且PHA作为一种新型生物工程材料,在工业、农业、食品业、医药学、精细化工中也极具应用前景。
　　 聚3-羟基丁酸[P(3HB)]是PHA中最常见的一种,也是研究和了解得最透彻的一种。但是由于其质地发脆,发硬,难于加工,其应用范围和价值受到了很大的限制。如果再其中插入4-羟基丁酸(4HB),形成聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)[P(3HB-co-4HB)],可以极大地改善P(3HB)聚合物这一缺点。另外,P(4HB)很容易被生物体内的脂肪酶或酯酶降解,并且降解速率相对其他PHA比较快,可用于制造医学工程材料。
　　 在前期的研究当中,P(3HB-co-4HB)的产生需要添加1,4-丁二醇、4-羟基丁酸、γ-丁内酯等直接前提物质,这些物质往往比较昂贵,这限制了P(3HB-co-4HB)的生产及应用。后来,有研究用葡萄糖为唯一碳源来生产P(3HB-co-4HB),但是4HB在聚合物中含量很低。敲除sad和gabD基因的菌株,可以使得4HB在聚合物中含量提高到11％,但是,4HB的含量还是有限。而且用到的琥珀酸半醛脱氢酶(sucD)和4-羟基丁酸脱氢酶(4hbD)是氧敏感性的酶,这限制了这条代谢途径在有氧条件下的应用。考虑到原料和酶活性的问题,本研究采用在厌氧条件下以葡萄糖为唯一碳源来合成P(3HB-co-4HB)。
　　 已有很多研究证明,厌氧条件下通过TCA循环的逆循环可以积累琥珀酸,那么只要表达琥珀酰辅酶A-辅酶A转移酶(catl)就可以产生琥珀酰辅酶A,然后通过琥珀酸半醛脱氢酶(sucD)、4-羟基丁酸脱氢酶(4hbD)、4-羟基丁酸辅酶A-辅酶A转移酶(cat2),在厌氧条件下即可合成4HB,这样解决了sucD、4hbD氧敏感性的问题。
　　 本研究选用高产琥珀酸的大肠杆菌工程菌株W3110GAB,其中敲除了ptsG、ldhA、pflB三个基因,并且采用基因工程手段,外源表达catl、sucD、4hbD、cat2基因,使得大肠杆菌能够在厌氧条件下以葡萄糖为唯一碳源来合成P(3HB-co-4HB),验证了该途径积累P(3HB-co-4HB)的可行性。
　　 本研究采用厌氧发酵生产P(3HB-co-4HB)的新方法,解决了传统研究中4HB的生产与sucD、4hbD酶活不高之间的矛盾,为理论研究和工业生产提供了新思路。本实验探究了有氧条件下生产4HB的新途径,虽然没有成功,但是为以后的研究奠定了基础。