CEACAM5在良性前列腺增生、前列腺上皮内瘤及前列腺癌中的表达差异及意义;有限采样法监测服用他克莫司和麦考酚钠肠溶片的中国肾移植受者的霉酚酸浓度的初步研究

摘要

论文一、CEACAM5在良性前列腺增生、前列腺上皮内瘤及前列腺癌中的表达差异及意义
　　研究背景:
　　多年以来，前列腺癌作为男性特有生殖器官肿瘤，一直处于举足轻重的地位。在诸多的恶性肿瘤中，前列腺癌的发病率一直是欧美男性的癌症发病率之首;而由此而导致的死亡率也仅次于肺癌，位居第二。故而，一直以来，对欧美国家前列腺癌的研究较多。因为人种、地理位置、饮食结构等差异，我国与西方欧美国家相比，前列腺癌的发病率和死亡率都低很多，但近年来国人前列腺癌的发病率也增长迅速，其对国人健康带来的严重威胁不容忽视。究其原因，主要是随着我国经济迅速增强，国人的生活水平迅速提高，与过去的生活方式、饮食结构不可同日而语，加上人们医疗保健意识的增强、医疗水平的提高以及人均寿命的延长等。早期前列腺癌的预后较好，手术治疗效果满意。但因前列腺的特殊生理结构和位置，大多数前列腺癌的表现无特异性，许多临床症状与体征与良性前列腺增生症十分相似，而且与患者年龄有明显的相关性，因而往往在疾病早期，被人们所忽视，延误治疗。很多患者一旦确诊就已经处于临床晚期，失去手术机会，甚至发生远处转移，只能选择姑息保守治疗，治疗效果往往不甚满意。
　　前列腺癌的发生发展是一个复制的过程，多因素参与其中，到目前为止，仍有诸多机制不甚明了。业已证明，肿瘤的发生与细胞凋亡的缺失有着密切的关系。CEACAM5基因编码CEA蛋白，后者是一种联系细胞间的粘附分子。除了其细胞粘附与迁移的作用外，CEACAM5还参与细胞内信号的传导，另外，CEACAM5还通过促进细胞外基质的粘附作用来抑制凋亡，从而诱导肿瘤的发生与转移。CEACAM5的诱导肿瘤发生的作用在很多恶性肿瘤中已经证实。其大部分研究局限于消化系统肿瘤，在泌尿系肿瘤中的作用尚待考证。
　　目的:
　　我们设计了这个课题，从形态学、分子学及蛋白质等多层面来证实CEACAM5在前列腺癌、前列腺上皮内瘤及良性前列腺增生组织中的表达差异，通过联系前列腺癌的临床病理参数进行统计学分析，探讨CEACAM5在前列腺肿瘤的发生发展的作用机制，确定CEACAM5在前列腺癌的早期诊断中的作用，对前列腺癌的发生机制进行研究，为前列腺癌的早期干预和免疫基因治疗探索出新的思路。
　　材料与方法:
　　选取2009年6月至2012年3月间，在山东大学泌尿外科研究所及山东大学齐鲁医院泌尿外科行前列腺癌根治术的前列腺癌患者37例，手术切除或经直肠超声前列腺活检病理证实为前列腺上皮内瘤病例28例，开放手术切除或经尿道前列腺电切良性前列腺增生标本10例。所有标本均行病理学检查，所有患者术前均未接受任何的放疗、化疗。所有标本病历资料齐全，随访信息完整。患者年龄在58-84岁之间，平均年龄71岁。所取每一例标本均分为2份，其中一份用10％福尔马林固定后，石蜡包埋做病理切片用于免疫组化分析，另外一份新鲜组织标本经液氮快速冷冻后保存到-80℃冰箱中，用于实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)及Western blot检测。所有前列腺癌标本包括肿瘤对应的癌旁组织一块，保存方法同上。
　　本研究分为三小节进行:
　　第一节应用免疫组化法分析CEACAM5在前列腺癌组织、前列腺上皮内瘤、良性前列腺增生组织中的表达。分别应用双标记CD34和D2-40定量标本组织中的微血管密度(MVD)和微淋巴管密度(LVD)，探讨CEACAM5在三组标本中的染色差异，以及其与标本组织中MVD和LVD的关系，分析CEACAM5在肿瘤组织阳性表达与前列腺癌的临床分期、病理分级等临床病理资料的关系。
　　第二节应用实时荧光定量PCR法分析CEACAM5基因在前列腺癌、前列腺上皮内瘤和良性前列腺增生组织中mRNA的表达差异。首先采用Trizol法提取前列腺癌组织、前列腺上皮内瘤、良性前列腺增生组织总RNA，应用20μl逆转录反应体系(其中含总RNA1μl)反转录合成，采用相对荧光定量对每个标本CEACAM5基因和GAPDH内参基因进行荧光定量PCR检测，通过荧光定量PCR检测CEACAM5基因的表达量的改变，对比前列腺癌组织、前列腺上皮内瘤、良性前列腺增生组织的CEACAM5 mRNA的表达情况，统计学分析其表达差异，并结合前列腺癌的Gleason分级和临床分期分析CEACAM5的mRNA水平与前列腺癌分级、分期的关系。
　　第三节应用Western blot技术对三组标本进行CEACAM蛋白检测，分析其蛋白表达定量差异。并结合临床病理资料进行相关性分析。
　　统计学分析应用t检验、q检验、Fisher精确检验以及Pearson卡方检验法等进行。检验水准P＜0.05。所有统计学分析使用统计软件SPSS17.0完成。
　　结果:
　　第一节免疫组化结果显示在良性增生前列腺组织中，所有标本对抗体均无免疫显色反应，CEACAM5蛋白信号均为阴性。而在前列腺癌组织以及前列腺上皮内瘤中进行免疫染色，CEACAM5蛋白显色阳性，且显色部位明显不同，前列腺癌组织中大部分显色于细胞浆，而前列腺上皮内瘤中更多的显色于细胞膜。统计学分析三组间差别有统计学意义。在前列腺癌中，CEACAM5蛋白信号的表达与肿瘤的Gleason分级呈密切相关(P＜0.05)，与肿瘤分期、淋巴结转移无有明显相关性(P＞0.05)。另外对标本进行MVD及LVD计数分析，在前列腺癌标本的MVD值明显高于前列腺上皮内瘤及良性前列腺增生标本(P＜0.05)，且MVD与CEACAM5表达呈正相关(P＜0.05)，而前列腺癌中的LVD数值明显低于前列腺上皮内瘤及良性前列腺增生(P＜0.05)，联系临床病理指标，MVD、LVD分别与肿瘤的分级、分期有相关性(P＜0.05)。
　　第二节通过设计特定的引物并利用实时定量荧光RT-PCR技术，在肿瘤组织和前列腺上皮内瘤中以及良性增生前列腺组织都检测出CEACAM5 mRNA，但水平不同。对比在前列腺癌组织和前列腺上皮内瘤的表达，我们发现CEACAM5mRNA量在前列腺癌组织中明显高于前列腺上皮内瘤，其差别经卡方检验有统计学意义(P＜0.001)。将CEACAM5mRNA联系前列腺癌的Gleason分级以及临床分期等临床病理资料，发现CEACAM5 mRNA表达与前列腺癌的Gleason分级及患者年龄有关(P＜0.05)，与临床分期、有无淋巴结转移等无相关性(P＞0.05)。CEACAM5 mRNA在前列腺癌组织中的扩增量明显高于相应的癌旁组织，且将二者CEACAM5 mRNA比值与术前患者血清PSA水平进行对比，前者对肿瘤的诊断符合率更高(P＞0.05)。
　　第三节应用western blot技术检测前列腺增生、前列腺上皮内瘤及前列腺癌组织中的CEACAM5蛋白表达情况，发现在三组标本中CEACAM5蛋白表达量依次增高(P＜0.05));在Gleason分级高的肿瘤中表达更高(P＜0.05)。在肿瘤组织中的表达量与年龄成正相关，与临床分期无相关性(P＞0.05)。
　　结论:
　　(1) CEACAM5在前列腺癌、前列腺上皮内瘤以及良性前列腺增生组织中有不同的表达模式，这种模式的不同以及与MVD的相关性可能提示CEACAM5在前列腺组织中通过促进毛细血管生成参与肿瘤的发展进程。
　　(2) CEACAM5 mRNA及CEACAM5蛋白在前列腺上皮内瘤和前列腺癌组织中的水平明显不同，且在肿瘤组织中的水平与前列腺癌的Gleason分级有关，提示CEACAM5和前列腺癌的恶性程度有密切关系，可作为判断前列腺肿瘤预后的辅助指标。
　　(3) CEACAM5 mRNA在肿瘤组织和癌旁组织中的比值较PSA更能准确诊断前列腺癌，且干扰因素少。可以作为前列腺细胞癌新的分子诊断标记。
　　论文二、有限采样法监测服用他克莫司和米芙的中国肾移植受者的霉酚酸浓度的初步研究
　　背景和目标:
　　对肾移植受者的免疫抑制方案进行药物浓度监测可以有效预防移植物排斥及药物毒性。霉酚酸作为一种广泛应用的免疫抑制剂，常常与钙调蛋白抑制剂及类固醇激素联合。经证实霉酚酸能够有效减少肾移植受者急性排斥反应和慢性移植肾衰竭的发生率[1-4]。许多研究已经证实，有限采样法能够评估服用吗替麦考酚酯的患者的霉酚酸曲线下面积AUC，以此来指导临床用药方案及剂量的调整。
　　然而霉酚酸的数据仍不完全。特别是服用麦考酚钠肠溶片（米芙）患者的MPA的数据仍处于摸索阶段。我们的实验是研究中国肾移植受者服用麦考酚钠肠溶片的霉酚酸药代动力学特征，并通过有限采样法研究0-12小时的药物曲线下面积。
　　方法:我们入选了20例接受麦考酚钠肠溶片联合他克莫司、泼尼松三联免疫抑制方案的肾脏移植受者。在其肾功稳定期监测患者服用麦考酚钠肠溶片后0.5，1，1.5，2，4，6，8，10，12小时的血浆霉酚酸浓度水平，评估计算药物活性成分霉酚酸的曲线下面积。实验数据收集是在肾移植术后21天进行。应用Origin7.5有限采样法，多元线性回归分析，及Bland-Altman分析来计算MPAAUC。
　　结果:患者的麦考酚钠肠溶片的血浆MPA水平及AUC变异很大。最佳有限采样法有4点法和3点法，公式分别为AUC0-12h(mg·h-1·L-1)=12.119+0.676×C1.5h+1.685×C4h+1.429×C6h+2.573×C8h以及AUC0-12h(mg·h-1·L-1)=12.820+0.662×C1.5h+1.750×C4h+4.213×C8h。经过验证，实验数据可以接受。四点法校整的相关系数r=0.861，P＜0.001三点法校正的相关系数r=0.882，P＜0.001。
　　结论:目前的实验结果表明:对于服用麦考酚钠肠溶片+他克莫司+泼尼松三联免疫抑制方案的汉族肾移植受者，在服药后1.5，4，6，8小时或者1.5，4，8小时行有限采样法监测MPA血浆浓度能够提供可信度和准确度较高的麦考酚钠肠溶片的AUC估计。

目录

声明

论文一 CEACAM5在良性前列腺增生、前列腺上皮内瘤及前列腺癌中的表达差异及意义

摘要

符号说明

前言

第一节 免疫组化法测定前列腺癌、上皮内肿瘤以及良性前列腺增生组织中CEACAM5的表达及其与MVD／LVD的关系

第二节 利用实时荧光定量PCR技术检测不同前列腺病变标本的CEACAM5基因

第三节 利用Western blot技术检测CEACAM5蛋白在前列腺病变组织中的表达

结论

附图表

参考文献

论文二 有限采样法监测服用他克莫司和米芙的中国肾移植受者的霉酚酸浓度的初步研究

摘要

符号说明

前言

材料与方法

统计分析

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

麦考酚钠肠溶片在器官移植中的应用综述

致谢

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