线粒体相关代谢性肌病的生物化学、分子遗传学发病机制和药物治疗机制研究

摘要

代谢性肌病是由先天缺陷导致的一类由于体内糖原、脂类、线粒体等产能物质发生异常而引起的疾病。代谢性肌病主要包括三类:线粒体肌病、脂肪酸氧化缺陷（fattyacidoxidationdefects，FAODs），和糖原累积病(glycogenstoragediseaseGSDs)。有人也把肌腺苷酸脱氨酶缺乏性肌病(myoadenylatedeaminasedeficiency,MADA)归为代谢性肌病。临床表现的类型与肌病的种类有关。代谢性肌病患者神经肌肉异常的临床表现可以发生于各种年龄。新生儿和婴儿多以肌张力低下和多系统受累（包括脑和肝脏）为主要表现。而其他年龄发病的患者则多表现为运动不耐受，同时伴有或不伴有进行性肌无力和肌红蛋白尿。一般而言，糖原累积病(GSD)多表现为对高强度运动的不耐受，而线粒体肌病和脂肪酸氧化异常(FOADs)多表现为对长时间运动的不耐受性，或者表现为对禁食和其他应激状态的不耐受性。
　　线粒体在代谢性肌病发病机制中起到决定性作用，直接影响ATP生成系统和产能。除了在线粒体病中发现的一系列线粒体DNA突变之外，近年来人们逐渐认识到由核基因突变引发的线粒体缺陷并不在少数，该类疾病符合孟德尔遗传定律。例如常染色体隐性遗传的线粒体神经消化道肌病（MNGIE，TP基因）、Leigh病(NDUF和SURF-1基因)、线粒体DNA耗竭综合征(dGuOK和TK)以及一些线粒体DNA缺失综合征(twinkle，OPA1)。常染色体显性遗传基因缺陷导致的线粒体缺失综合征虽然罕见，但也存在。还有一些罕见的基因突变影响了线粒体的转运系统。这些由单基因突变引发的遗传代谢性肌病所影响的靶蛋白绝大多数是最终在线粒体基质内发挥催化作用的酶类，这些酶类的缺乏导致了线粒体内部电子传递、DNA原料合成和底物转运，最终影响整个线粒体的氧化功能效率。
　　本研究主要涉及两种代谢性肌病，一种是由核基因ETFDH突变导致的多种酰基辅酶A脱氢缺陷，进而导致脂肪酸氧化异常，即多酰基辅酶A脱氢缺陷(MultipleCoenzymeADehydrogenationDeficiency，MADD)，ETFDH基因编码产物ETF-QO蛋白位于线粒体内膜，负责各种长度酯酰辅酶A脱氢后的向线粒体呼吸链的电子传递。因此本病既属于脂肪酸氧化缺陷类代谢性肌病，又与线粒体内部的电子传递密切相关。另外一种是由核基因TK2突变导致的线粒体DNA耗竭综合征（MtDNADepletionSyndrome，MDS），该基因突变导致编码产物胸苷激酶2（ThymidineKinase2）活性极度减低，致使线粒体DNA合成原料dNTP严重缺乏，引起线粒体DNA耗竭，最终导致线粒体内部由线粒体DNA编码的各类蛋白表达缺陷而发病。作为对线粒体相关疾病研究的拓展，我们采用钙成像系统进一步研究某些药物（如格列苯脲）对线粒体膜电位的改变、及其与氧自由基和钙离子超载等线粒体代谢相关环节之间的相互作用。
　　第一部分:维生素B2对核黄素反应性多酰基辅酶A脱氢缺陷（RR-MADD）患者成纤维细胞中黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的上调和对黄素蛋白的稳定作用
　　核黄素反应性多酰基辅酶A脱氢缺陷（RR-MADD）被证实与线粒体内多种酶功能缺陷有关，但直到最近几年，该病的遗传缺陷才被明确，RR-MADD是由电子转运黄素蛋白（Electrontransferflcwoprotein，ETF）或电子转运黄素蛋白脱氢酶（Electrontransferflowoprotein-ubiquinomoxidoreductase，ETF-QO）缺陷所引起。虽然致病基因已经明确，但其对维生素B2（即核黄素）治疗有效的原理，以及核黄素对线粒体相关酶类的表达及活性的影响尚不完全明确，甚至处于研究的初始阶段。本研究通过收集我院就诊的7例RR-MADD患者肌肉组织和体外培养的成纤维细胞，并对经不同浓度核黄素处理的细胞内的ETF-QO和琥珀酸脱氢酶(succincotedehydrogenase，SDH)的表达和活性进行检测。同时检测各浓度下黄素腺嘌呤二核苷酸(FlawinAdenincDinucleotide，FAD)的在线粒体中的浓度。我们的研究结果表明患者成纤维细胞和治疗前肌肉中线粒体内的FAD含量较正常对照明显减低，体外细胞培养中加入核黄素后，ETF-QO蛋白量表达明显升高，最终与对照组一致。患者肌肉和成纤维细胞中的SDH表达及活性在加药前也轻度低于正常对照，而在加入核黄素后表达量和活性均明显提高至正常水平。线粒体FAD含量在加入核黄素后同样得到明显上调。由此我们得出结论:在RR-MADD患者线粒体中存在异常的FAD池和明显减低的黄素蛋白表达（以ETF-QO和SDHA为代表），这些黄素蛋白的低表达可能影响线粒体其它蛋白的正常功能。核黄素能够上调线粒体FAD的水平，近而促进异常的ETF-QO蛋白分子与FAD辅基结合形成全酶，稳定的全酶不易于降解，从而提高了蛋白的稳定性。
　　第二部分基于iTRAQ多重标记技术对核黄素反应性多酰基辅酶A脱氢缺陷患者服用核黄素前后的差异蛋白质组学研究
　　多酰基辅酶A脱氢缺陷(MADD)是一种累及骨骼肌，以运动不耐受、易疲劳为主要表现的疾病。该病的无明显诱因，易于复发，部分患者服用核黄素（维生素B2）可使症状自行缓解，称为核黄素反应性MADD(RR-MADD)。本研究首次采用相对和绝对定量的等量异位标签多重标记串联质谱技术iTRAQ(isobarictagforrelativeandabsolutequantitation)，在“整体”蛋白组范围内，对RR-MADD患者用药前后的肌肉组织进行高通量的“全组”蛋白直接鉴定和相对定量分析，绘制出RR-MADD疾病特异性蛋白质图谱，以获得参与RR-MADD调节通路的新的关键因素。为进一步阐明RR-MADD的发病机制及核黄素的治疗机理提供新的方法和依据。iTRAQ是一种基于串联质谱方法的蛋白质定量技术。本次试验采用的8标iTRAQ试剂，其中包括8种等量的同位素试剂，能对蛋白质酶解后肽段进行标记，从而通过串联质谱方法，可以对肽段进行精确鉴定和定量。结果共鉴定了四百多个蛋白质。与用药前相比，用药后标本中共发现两倍以上表达差异的蛋白质419个，其中上调的208个，下调的211个。我们对在用药前出现低表达的线粒体相关蛋白、细胞死亡相关蛋白进行了Westernblot验证，分析了以上蛋白表达水平与RR—MADD和核黄素治疗的相关性，并提出RR-MADD致病模型和RR-MADD核黄素治疗转归模型（即“核黄素开关”模型）。以上模型有望成为核黄素治疗RR-MADD机制的关键点，并有望为其他类型非代谢类疾病的治疗从代谢的角度给出新的启发。本研究采用该技术获得了RR-MADD患者口服核黄素治疗前后肌肉蛋白质组差异表达图谱;深入研究这些蛋白的分子机制将有助于进一步阐明RR-MADD的发病机理，为核黄素对RR-MADD的治疗机制提供新的理论支持。
　　第三部分:TK2基因新发突变导致的婴儿发病的线粒体DNA耗竭综合征(MDS)一例及其家系研究
　　线粒体胸苷激酶2(TK2)是线粒体内的一种脱氧核苷酸激酶，它主要负责催化胸苷和脱氧胞苷的第一步磷酸化，使之变成相应的单磷酸腺苷。在本研究中，我们报道中国首例骨骼肌型的线粒体DNA耗竭综合征，患者为婴儿起病，主要表现为肌张力低下，逐渐进展，5个月后因呼吸衰竭死亡。肌肉活检显示标本中存在大量COX缺失纤维，伴有大量的脂滴沉积。我们对患者和其父母的血DNA进行TK2基因外显子测序，结果显示患者本人及其父亲均带有5号外显子内的一个新发点突变(p.R104H)。随后对其一家三口行多重连接探针扩增技术（multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA）检测发现患者及其母亲体内均带有TK2基因5-10号外显子的一段长于19.5kb的大片段缺失。体外培养患者成纤维细胞并检测线粒体酶活性显示呼吸链酶复合体Ⅱ活性轻度下降，复合体Ⅰ和复合体Ⅲ活性明显下降。患者外周血和肌肉组织中线粒体DNA拷贝数明显减低，而其母亲外周血线粒体DNA拷贝数也呈中度减低。该病例及其家系研究进一步丰富了目前国际上报道的线粒体DNA耗竭综合征临床表现形式，主要特点为婴儿起病，同时存在线粒体和脂类代谢异常。患者携带的片段缺失长度较大，导致TK2活性严重减低，可能是导致其早期发病和严重表型的主要原因。
　　第四部分:格列苯脲对巨噬细胞内活性氧的抑制和线粒体活性的改变以及降低ATP介导的钙离子浓度升高
　　目前已经有越来越多的证据表明格列苯脲（glibenclamide）有广泛的抗炎症反应作用。然而，目前仍未出现格列苯脲对Raw264.7巨噬细胞内静息和ATP诱导状态下胞内钙离子浓度[Ca2+]i变化的相关研究。在本研究中[Ca2+]i的瞬变活性氧(ROS)检测以及线粒体功能检测都通过高速TILLvisION数字化成像系统完成。在对相应指示剂如Furo2-am，DCFDA和rhodamin-123的监测下获取。我们发现格列苯脲吡那地尔(pinadile)和其它非选择性钾离子通道抑制剂对Raw264.7细胞中的静息[Ca2+]i无影响。细胞外ATP浓度的升高（100μm）能够引起[Ca2+]i的一过性升高，这主要是通过耗竭钙库来实现的。一过性钙增高能够在ROS清除剂（钛剂）和线粒体抑制剂（鱼藤酮）的作用下受到抑制。格列苯脲和5-羟基癸酸(5-hydroxydecanoaye，5-HD)同样也能降低ATP诱导的钙增高，但是吡那地尔和非选择性K+通道抑制剂则对此毫无作用。此外格列苯脲能够降低细胞内ROS含量和线粒体的活性。在被钛剂和鱼藤酮预先处理过的细胞中格列苯脲的加入无法降低[Ca2+]i的一过性升高。然而外源性的过氧化氢(H2O2)可以克服格列苯脲的作用。由此我们得出结论:格列苯脲能抑制ATP介导的[Ca2+]i一过性升高，其原理是通过阻断Raw264.7巨噬细胞中线粒体上的ATP敏感性钾通道(KATP)进而降低了ROS的产生和线粒体功能实现的。