抑制自噬上调内质网应激性凋亡增强Meloxicam对肝细胞癌杀伤力机理的研究

摘要

目的:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一种常见的严重威胁人类健康且恶性程度极高的消化道肿瘤。在世界范围内，HCC的发病率居第6位，而致死率则居第2位。目前，仅有20％的HCC患者能够接受有效的治疗，针对中晚期HCC患者的有效治疗手段仍然很少。索拉非尼是目前唯一被证实可改善进展期HCC患者生存情况的靶向药物，但是与安慰剂相比较，索拉非尼仅仅能延长晚期HCC患者2-3个月的中位生存期。由此可见，深入探寻HCC恶性增殖以及凋亡抵抗的分子机制，寻找新策略和方法来改变目前HCC的治疗现状具有十分重要的意义。越来越多的证据显示环氧合酶2(COX-2)的表达影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡抵抗。美洛昔康（Meloxicam）作为选择性的COX-2抑制剂和非甾体类抗炎药(NSAID)已经被广泛的应用于炎症的治疗。此外，Meloxicam能够通过降低COX-2的表达抑制肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡。但是，Meloxicam杀伤HCC的具体机制至今仍不明了。HCC在其发生发展过程中要不断应对各种理化因素的刺激，肝癌细胞在应对机体这种微环境的改变时必然会产生一系列反应来改变其生物学行为或功能，而内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)就是HCC常见的一种应激性反应。内质网应激与细胞内多种信号传导通路之间具有相互作用，因此，有必要阐明肝癌细胞在内质网应激状态下增殖活性和凋亡抵抗能力的变化。自噬是细胞高度保守的过程，它通过形成自噬体将物质转运至溶酶体进行降解，是维持细胞稳态的重要机制。之前的研究结果显示一些抗肿瘤治疗能够导致肿瘤细胞的自噬和凋亡，靶向作用于自噬能够增强肿瘤化疗的敏感性。基于此，我们设计了本实验来探讨靶向作用于细胞自噬是否能够通过上调内质网应激性凋亡增强Meloxicam对肝癌细胞的杀伤力。
　　方法:首先选取5种最为常见的人肝癌细胞系-HepG2、Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721和SMMC-7402，应用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒检测这5种肝癌细胞的细胞活力，筛选出其中对Meloxicam治疗最为敏感的两种细胞株（HepG2和Bel-7402）进行下一步实验。应用流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测HepG2和Bel-7402两种肝癌细胞经不同浓度Meloxicam处理后细胞凋亡率的变化。采用Western blot检测内质网应激相关蛋白IRE1，GRP78/Bip以及磷酸化eIF2α的表达。同时，应用免疫荧光实验(Immunofluorescence Assay)进一步检测GRP78的定位表达情况。应用Western blot检测经不同浓度Meloxicam处理后，HepG2和Bel-7402细胞中内质网凋亡特异性蛋白Caspase-12以及凋亡执行蛋白Caspase-3和PARP蛋白的表达。通过RT-PCR检测Meloxicam对Caspase-12mRNA表达的影响。另外，应用细胞凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK，Z-VAD)进一步探讨Meloxicam诱导HepG2和Bel-7402细胞凋亡的分子机制。实验中应用小干扰RNA(siRNA)特异性沉默GRP78，然后应用CCK-8检测经Meloxicam处理后，HepG2和Bel-7402的细胞活力;应用Western blot检测GRP78蛋白的表达情况;应用流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡率的变化。（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是GRP78的抑制剂，应用AnnexinⅤ/PI双染法和Westem blot检测EGCG对Meloxicam诱导HepG2和Bel-7402细胞凋亡的影响。应用Western blot检测自噬激活的标志性蛋白Beclin-1，Atg5，Atg7，LC3和p62的表达。然后应用免疫荧光染色检测经Meloxicam处理后，HepG2和Bel-7402细胞LC3的变化。为了进一步探讨自噬是否在Meloxicam介导的HepG2和Bel-7402细胞凋亡中发挥重要的作用，我们应用细胞自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）和Atg5siRNA特异性沉默Atg5来抑制Meloxicam诱导的HepG2和Bel-7402细胞自噬的激活。分别应用流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法和Westem blot检测HepG2和Bel-7402细胞的凋亡率以及自噬和内质网应激性凋亡相关蛋白LC3、Atg5和Caspase-12的表达情况。为了进一步研究GRP78蛋白是否参与了Meloxicam诱导HepG2和Bel-7402细胞自噬的激活，分别应用GRP78 siRNA和EGCG抑制GRP78蛋白的表达，应用Western blot检测HepG2和Bel-7402细胞自噬标志蛋白LC3的表达。为了明确AMPK-mTOR信号通路在Meloxicam处理的HepG2和Bel-7402细胞中是否参与了GRP78蛋白调控的细胞自噬，分别应用GRP78siRNA和EGCG抑制GRP78蛋白的表达，应用Western blot检测HepG2和Bel-7402细胞AMPK和mTOR的表达。为了进一步研究这其中的分子机制，分别应用AMPK特异性抑制剂compound C和mTOR特异性抑制剂Rapamycin抑制AMPK和mTOR的表达，应用Western blot检测HepG2和Bel-7402细胞LC3的表达。
　　结果:CCK-8实验显示经不同浓度Meloxicam处理后，这五种肝癌细胞的细胞活力与对照组相比均有明显的下降，并且在Meloxicam浓度为80μM时，对细胞活力的抑制率达到峰值。由于HepG2和Bel-7402两种肝癌细胞对Meloxicam的敏感性较其它肝癌细胞高，因此，选择这两种细胞进行下一步实验。流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡显示Meloxicam能够诱导HepG2和Bel-7402细胞凋亡，并且呈现出浓度依赖性。进一步研究其分子机制，Western blot蛋白检测结果显示经Meloxicam处理后，HepG2和Bel-7402细胞内质网应激标志性蛋白IRE1、GRP78/Bip以及磷酸化的elF2α明显增高且呈现出浓度依赖性。免疫荧光染色的方法观察GRP78的定位表达，结果显示与对照组相比，Meloxicam能够明显增强GRP78的定位表达。Caspase-12的表达与内质网应激性凋亡相关，本实验中，Westem blot蛋白检测结果显示Meloxicam激活了Caspase-12的表达，这与细胞凋亡的分析结果是一致的。同时通过Western blot蛋白检测我们也观察到凋亡执行蛋白Casapse-3和PARP的表达也随着Meloxciam浓度的增加而上调。RT-PCR结果显示Meloxicam同样能够增强Caspase-12 mRNA的表达。另外，我们应用凋亡抑制剂Z-VAD来分析Meloxciam对HepG2和Bel-7402细胞凋亡的影响。流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡显示Z-VAD明显降低了Meloxicam诱导肝癌细胞凋亡的作用。说明Meloxicam导致的内质网应激能够触发HepG2和Bel-7402细胞的凋亡，同时Caspases蛋白参与了这一过程。应用GRP78 siRNA特异性沉默HepG2和Bel-7402细胞中GRP78的表达。CCK-8细胞活力检测发现抑制GRP78明显降低了肝癌细胞的细胞活力。Western blot蛋白检测结果显示与对照组相比，GRP78 siRNA明显降低了肝癌细胞GRP78的表达，同时流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡结果显示抑制GRP78的表达能够明显增强Meloxicam诱导肝癌细胞凋亡的能力。接下来，我们应用GRP78特异性的抑制剂EGCG继续探讨Meloxicam诱导肝癌细胞凋亡的分子机制。Western blot蛋白检测结果显示与对照组相比，EGCG明显下调了HepG2和Bel-7402细胞中GRP78的表达，流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡结果显示联合EGCG能够显著增强Meloxicam诱导肝癌细胞凋亡的能力。通过Western blot蛋白检测，我们发现Meloxicam显著增强了自噬标志性蛋白Beclin-1，、Atg5、Atg7和LC3的表达，相反，Meloxicam下调了HepG2和Bel-7402细胞中p62蛋白的表达。为了进一步证实Western blot的检测结果，我们对LC3进行免疫荧光染色，结果发现与对照组相比，Meloxicam明显增强了肝癌细胞中LC3的定位表达。接下来，我们探讨自噬在Meloxicam诱导肝癌细胞内质网应激性凋亡中起到何种作用。我们应用细胞自噬特异性的抑制剂3-MA抑制HepG2和Bel-7402细胞的自噬。流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡显示3-MA明显增强了Meloxicam诱导肝癌细胞凋亡的能力，而3-MA单独用药并不能明显导致肝癌细胞的凋亡。Western blot蛋白检测结果显示3-MA降低了LC3的表达，相反，上调了Caspase-12的表达。接下来，我们应用Atg5 siRNA特异性干扰Atg5的表达抑制自噬，同样通过流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡以及Western blot蛋白检测结果显示抑制Atg5的表达显著增强了Meloxicam介导的肝癌细胞内质网应激性的细胞凋亡。通过Western blot实验我们发现抑制GRP78蛋白的表达能够下调HepG2和Bel-7402细胞LC3的表达。表明下调GRP78蛋白的表达能够抑制Meloxicam诱导的肝癌细胞自噬的激活。AMPK-mTOR信号通路在细胞自噬的调控中起到重要的作用。因此，我们探讨该信号通路是否参与了GRP78调控肝癌细胞自噬的激活。Western blot蛋白检测结果显示Meloxicam激活了AMPK但是抑制了mTOR的磷酸化。相反，应用GRP78 siRNA或者EGCG则抑制了AMPK，而增强了mTOR的磷酸化。为了进一步研究AMPK-mTOR信号通路在Meioxicam诱导肝癌细胞自噬中所起作用的分子机制，我们应用AMPK特异性的抑制剂compound C处理HepG2和Bel-7402细胞。通过Western blot蛋白检测结果，我们发现compound C降低了Meloxicam诱导的AMPK的激活，同时，我们发现抑制AMPK的激活显著降低了LC3的表达。但是，Western blot蛋白检测结果显示应用mTOR特异性抑制剂rapamycin削弱了compound C对LC3的调控作用。为了进一步证实AMPK-mTOR信号通路在Meloxicam抗肝癌细胞中起到重要的作用，我们评估了compound C在Meloxicam诱导肝癌细胞凋亡中的作用。流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡显示compound C显著增强了Meloxicam对HepG2和Bel-7402细胞的杀伤力。表明AMPK-mTOR信号参与了肝癌细胞自噬的激活，而GRP78可能是通过AMPK-mTOR信号通路诱导HepG2和Bel-7402细胞自噬的激活。
　　结论:
　　1.COX-2抑制剂Meloxicam诱导内质网应激触发肝癌细胞的凋亡，Caspases蛋白参与了这一进程;
　　2.COX-2抑制剂Meloxicam诱导细胞自噬的激活增强了肝癌细胞凋亡抵抗的能力，削弱了内质网应激的压力，抑制自噬能够增强肝癌细胞内质网应激性凋亡;
　　3.内质网分子伴侣GRP78可能是通过AMPK-mTOR信号通路参与了Meloxicam诱导的肝癌细胞自噬的激活。抑制GRP78能够增强Meloxicam诱导肝癌细胞凋亡的能力。

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