调控ATP和NADH/NAD+比例提高大肠杆菌琥珀酸的合成

摘要

琥珀酸是一种重要的平台化合物，由于琥珀酸具有很大的应用潜力，它被认定为最重要的生物基大宗化学品之一。在大肠杆菌中提高琥珀酸合成的方法包括:阻断竞争性途径、激活乙醛酸支路、过表达琥珀酸生产的关键酶以及提高能量和还原当量的供应等。本实验室已经构建了一系列产琥珀酸大肠杆菌，本文首次通过底物比例的调整，以及呼吸链的改造、ATP无效循环等一系列策略来调节菌株胞内ATP的产生和NADH/NAD+比例，达到提高琥珀酸产量和产率的目的。
　　葡萄糖和木糖是纤维素水解液的主要成分，我们构建的产琥珀酸大肠杆菌YL104H可以以葡萄糖为底物高效的生产琥珀酸。进一步的研究发现YL104H也可以利用葡萄糖和木糖的混合糖来生产琥珀酸。然而，在发酵的厌氧阶段以单一的木糖为底物时YL104H菌株不能积累琥珀酸，我们推测可能是由于以木糖作为底物时厌氧生产能量供应不足导致的。通过分析以单一葡萄糖或单一木糖为底物时厌氧阶段ATP的产生情况。我们发现胞内ATP的水平会影响琥珀酸的产量，通过简单的调节底物中葡萄糖与木糖的比例就可以起到调节菌株胞内ATP水平的作用。之前的研究都是通过增加ATP的供应来提高琥珀酸的产量，本研究首次通过调控胞内ATP的产生达到最优水平，以此来提高琥珀酸生产。YL104H菌株以不同比例的混合糖的发酵生产琥珀酸，发现当葡萄糖与木糖的比例为1∶2的时候琥珀酸产量最高。接着我们利用人工调配的最佳葡萄糖与木糖的比例进行发酵优化，发现琥珀酸的产量可以达到一个比较高的水平。最后我们以木糖醇生产过程中得到的木糖废液作为发酵底物，YL104H菌株的琥珀酸产量达到61.66 g/L，全阶段的琥珀酸生产力为0.95 g/L/h。
　　实验室已构建的产琥珀酸工程菌株YL104也可以利用葡萄糖高效的生产琥珀酸，但全阶段琥珀酸产率仍有待提高。在本研究中，我们探究了以葡萄糖为底物时菌株胞内NADH/NAD+比例、ATP水平和全阶段琥珀酸产率三者之间的关系。首先通过代谢工程改造使YL104菌株在有氧和厌氧阶段均使用厌氧NADH脱氢酶，改造后的工程菌株全阶段琥珀酸产率提高了7％。为了进一步降低转厌氧时菌株胞内的NADH/NAD+比例，我们在YL104N菌株中异源表达来自酿酒酵母胞质可溶的延胡索酸还原酶FRDS，得到的工程菌株全阶段琥珀酸产率提高了13％，菌株厌氧胞内的NADH/NAD+比例与ATP水平都有所下降。我们还在厌氧阶段采用ATP无效循环策略使菌株YL104NP厌氧琥珀酸产量有了明显提高，全阶段琥珀酸产率提高了17％。同时采用过表达异源的FRDS和ATP无效循环策略，菌株全阶段琥珀酸产率达到1.36 mol/mol，相比于亲本菌株YL104提高了39％。提高能量和还原力的供应是提高琥珀酸产量常用的方法，本论文发现将胞内NADH/NAD+比例和ATP水平调控到一个合适水平更有利于增强琥珀酸合成，并且这些调节胞内NADH/NAD+比例和ATP水平的方法也可以应用在其他厌氧产物的生产过程中。

目录

声明

摘要

本论文的缩写词表

1．1 琥珀酸简介

1．1．1 琥珀酸的理化性质

1．1．2 琥珀酸的应用及市场需求

1．1．3 琥珀酸的合成方法

1．2 生产琥珀酸的菌株

1．2．1 天然生产宿主

1．2．2 工程宿主菌

1．3 利用代谢工程策略提高大肠杆菌合成琥珀酸的研究进展

1．3．1 提高大肠杆菌厌氧琥珀酸合成的研究进展

1．3．2 提高大肠杆菌有氧琥珀酸合成的研究进展

1．4 辅因子对琥珀酸生产的影响

1．4．1 细胞氧化还原平衡

1．4．2 胞内ATP水平

1．5 本论文的研究内容及意义

第二章 利用葡萄糖和木糖比例调节胞内ATP提高琥珀酸产量

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 寡核苷酸序列

2．1．3 分子生物学实验常用酶

2．1．4 本论文中所使用的试剂盒

2．1．5 常用生化试剂与药品

2．1．6 培养基与主要试剂

2．1．7 缓冲液以及主要试剂

2．1．8 实验所用到的仪器和设备

2．2 实验方法

2．2．1 菌种的保藏方法

2．2．2 细菌基因组DNA的提取

2．2．3 酵母基因组DNA的提取

2．2．4 质粒DNA提取

2．2．5 PCR扩增反应

2．2．6 PCR产物纯化回收

2．2．7 琼脂糖凝胶产物的纯化

2．2．8 酶切体系和方法

2．2．9 T4 DNA连接酶连接反应体系

2．2．10 体外组装方法

2．3 琥珀酸发酵条件

2．3．1 种子活化

2．3．2 四联罐发酵

2．3．3 3 L发酵罐发酵

2．4 检测方法

2．4．1 菌体生长情况的测定

2．4．2 葡萄糖的测定

2．4．3 琥珀酸、木糖以及副产物的测定

2．4．4 胞内ATP的测定

2．4．5 构建YL104H菌株的代谢模型以及代谢流平衡分析(FBA)

2．5 结果与讨论

2．5．1 不同碳源发酵生产琥珀酸的性能比较

2．5．2 分析厌氧发酵中工程菌株胞内ATP的水平

2．5．3 优化混合糖比例来调节胞内ATP水平提高琥珀酸产量

2．5．4 利用优化的混合糖发酵罐分批补料发酵生产琥珀酸

本章小结

第三章 调节胞内NADH／NAD+比例和ATP水平提高全阶段琥珀酸产率

3．1 实验材料

3．1．1 菌株和质粒

3．1．2 寡核苷酸序列

3．2 实验方法

3．2．1 本实验质粒载体的构建

3．2．2 其他实验方法

3．3 琥珀酸发酵条件

3．4 检测方法

3．4．2 胞内ATP的测定

3．4．3 其他检测方法

3．5 结果与讨论

3．5．1 在双阶段发酵中一致化NADH脱氢酶提高全阶段琥珀酸产率

3．5．2 引入来自酿酒酵母的FRDS1对工程菌株琥珀酸发酵的影响

3．5．3 引入厌氧ATP无效循环对工程菌株琥珀酸发酵的影响

3．5．4 共表达frd与ppsA基因来提高琥珀酸的产率

本章小结

创新性成果

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文