水蛭提取物对内皮细胞凝血相关因子以及对内皮功能紊乱相关分子的影响

摘要

心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVDs)是目前全球致死率最高的疾病，很快就会成为全球主要的健康问题。动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种进行性疾病，其主要特征是脂质和纤维类物质在大动脉中不断积累，它是造成心血管疾病日益增长的重要原因。
　　水蛭是我国传统的中药材，它具有破血、逐淤等功能，其煎剂、口服液等剂型广泛用于心血管疾病的防治。但是其不良反应也时有发生，其中出血不良反应最为突出，严重影响患者的健康。在前期对水蛭活性成分研究的基础上，我们推测可能是水蛭中的某些成分对机体的凝血因子产生了影响，使其凝血活性发生改变，从而导致了出血不良反应。而内皮细胞在机体凝血中有重要的作用。所以本论文以水蛭的干燥全体为原材料，采用不同的提取条件和转化条件，以期能获得一种既不影响内皮细胞中凝血相关因子mRNA的表达，又能够抑制AS发展的水蛭制备方法，从而找到一种临床可长期用于AS的预防，安全可靠的，出血不良反应弱的新型口服制剂。
　　具体的实验内容及结果如下:
　　1.不同条件下水蛭提取物的制备
　　本实验以水蛭的干燥全体为原材料，分别用水提、胃蛋白酶酶解、胃蛋白酶和胰蛋白酶联用双酶解和粗酶酶解四种制备方法得到4种水蛭提取物，分别命名为水蛭粉水提物(LP)、胃蛋白酶酶解水蛭提取物(PHL)、胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解的水蛭提取物(PTHL)和粗酶酶解的水蛭提取物(CEHL)。另外将得到的PHL和PTHL的水蛭提取物进行乳酸杆菌的代谢转化，得到了乳酸杆菌在MRS培养基中的代谢产物(MRS)、乳酸杆菌在不含氮源的MRS培养基中的代谢产物（MRS-1）以及乳酸杆菌在PHL作为氮源的MRS培养基中的代谢转化产物(MRS-2)和乳酸杆菌在PTHL作为氮源的MRS培养基中的代谢转化产物(MRS-3)4种提取物，共制备了8个样品。
　　2.不同水蛭提取物对内皮细胞凝血活性的影响
　　将提取得到的8个水蛭提取物作用于EA.hy926内皮细胞，利用RT-PCR对EA.hy926细胞凝血相关因子，包括促凝血因子PAI、vWF和抗凝血因子tPA、PS、TFPI、TM mRNA的表达量进行检测。结果发现在0-50μg/ml的浓度范围内，LP可以显著促进EA.hy926内皮细胞凝血相关因子mRNA的表达;PHL和MRS-1对EA.hy926细胞凝血相关因子mRNA的表达均无影响;PTHL可以显著降低EA.hy926细胞凝血相关因子mRNA的表达;CEHL可以促进PAI和PS mRNA的表达，但是对vWF、tPA、TFPI、TM的mRNA的表达均有一定的抑制作用;MRS可以促进EA.hy926细胞中PAI、vWF、tPA、TM mRNA的表达，而对PS和TFPI mRNA的表达无显著影响;MRS-3可以促进EA.hy926细胞中PAI、vWF、tPA、PS、TM mRNA的表达，而对TFPI mRNA的表达无显著影响。上述结果中只有PHL和MRS-1对EA.hy926细胞中凝血相关因子mRNA的表达无显著影响，MRS-1为对照组，所以接下来对PHL对内皮功能紊乱的影响进行探究。
　　3.胃蛋白酶酶解水蛭提取物对内皮细胞功能紊乱的保护作用。
　　我们首先以10 ng/mL TNF-α刺激EA.hy926细胞12h建立内皮功能紊乱的模型，经过TNF-α刺激后的EA.hy926细胞内ET-1、iNOS、MCP-1和IL-6 mRNA的表达量与对照组相比均有明显升高(＃p＜0.05)，而50μg/ml的PHL可以显著抑制由TNF-α诱导的ET-1、iNOS、MCP-1和IL-6 mRNA的表达量的升高（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。说明PHL对内皮细胞功能紊乱具有一定的保护作用。
　　综上所述，经过胃蛋白酶酶解的水蛭提取物PHL对EA.hy926内皮细胞中凝血相关因子PAI、vWF、tPA、PS、TFPI和TM mRNA的表达均无明显影响，而且在50μg/ml浓度下对由TNF-α诱导的内皮功能紊乱具有一定的保护作用。它为临床上可长期用于动脉粥样硬化的预防，出血不良反应弱的新型口服制剂的研发提供了实验基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1 中药水蛭概述

1．1 水蛭的主要治疗应用

1．2 水蛭的不良反应

2 机体凝血机制

2．1 血小板

2．2 凝血系统

2．3 血管壁细胞

3 动脉粥样硬化概述

3．1 动脉粥样硬化的发展过程

3．2 内皮功能紊乱与动脉粥样硬化

3．3 目前治疗动脉粥样硬化的药物

4 课题研究内容、意义

第二章 不同水蛭提取物对EA．hy926细胞凝血相关因子的影响

1 实验仪器与材料

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

1．3 实验试剂

1．4 主要试剂配方

1．5 引物序列

2 不同条件下水蛭提取物的制备

2．1 水蛭粉水提物的制备

2．2 胃蛋白酶酶解的水蛭提取物的制备

2．3 胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶解的水蛭提取物的制备

2．4 粗酶酶解的水蛭提取物的制备

2．5 乳酸杆菌代谢转化水蛭提取物的制备

2．6 EA．hy926细胞培养

2．7 RT-PCR检测不同水蛭提取物对EA．hy926细胞凝血相关因子的影响

3．实验结果

3．2 MTT实验检测水蛭不同提取物对EA．hy926内皮细胞存活率的影响

3．3 不同水蛭提取物对EA．hy926细胞凝血相关因子的影响

4 讨论

5 本章小结

第三章 PHL对内皮细胞功能紊乱相关分子的影响

1 实验仪器与材料

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

1．3 实验试剂

1．4 引物序列

2 实验方法

2．1 内皮功能紊乱模型的建立

2．2 PHL对内皮细胞功能紊乱相关分子的影响

3 实验结果

3．1 内皮功能紊乱模型的建立

3．2 PHL对内皮细胞功能紊乱相关分子的影响

4 讨论

5 本章小结

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文