掺锶纯钛种植体表面的制备、表征及生物学性能研究

摘要

牙种植体由于其良好的功能及美学效果，已经成为目前临床上被大众所认可的修复缺损牙的最佳治疗方案。然而，目前常规种植治疗耗时较长，从拔牙到最终完成修复至少需要3个月的时间，这在很大程度上影响了患者对种植这一治疗方案的接受程度。目前，种植体表面处理被国际上认为是提升种植体骨结合最为有效的方法。通过对牙种植体进行表面处理能够使其表面形貌、亲水性和表面化学组成等发生改变，从而影响骨结合的效果。对纯钛种植体表面的形貌的改变最为经典的是喷砂酸蚀形成的微米级表面，种植体的微米级表面形态会影响成骨细胞在其表面的黏附从而影响增殖分化等后续生物学行为;另一方面表面微结构能够增加骨与微种植体的接触面积，更利于应力的分布。目前该表面处理技术已经成为口腔种植体市场应用最为广泛的处理方法，而且这种方法也已经被人们所验证。但是这些表面形貌的改变对于种植体周围组织的主动影响（如促进骨生成以及阻止骨吸收等）有限。因此，目前的研究更多的关注于如何提升牙种植体对周围组织的主动影响上。
　　在种植体表面引入新的元素使其表面的生物化学性质发生改变，从而促使其表面成骨细胞的活性增强，以达到增进种植体表面骨结合的目的是目前常用的促进骨结合的方法。作为人体所必需的一种微量元素，有研究显示锶对于骨组织的改建有一定的作用，它不仅可以促进骨形成，同时还能够对骨吸收产生抑制作用。目前该元素在临床上主要是以雷纳酸锶化合物的形式应用于骨质疏松症患者。然而全身用药除了会给患者带来一定的副作用以外还不能在局部靶向性的成骨。因此，锶的局部应用开始被学者们所重视，并且已成为目前研究的热点。该研究借助磁控溅射技术，将具有促进骨形成、抑制骨吸收双重作用的锶元素溅射到牙种植体的表面。同时，配合可以在种植体表面形成微米级形貌的经典的喷砂酸蚀方法，以期在种植体表面组装出掺锶的微米化仿生涂层，通过体内外实验验证其对成骨细胞生物学行为及种植体周围骨结合的影响，为种植体临床应用提供实验依据。
　　研究目的:
　　1.应用磁控溅射技术和大颗粒喷砂酸蚀技术在种植体和钛片表面进行掺锶微米化仿生涂层的构建，并对其理化性质进行评价。
　　2.进行体外细胞实验，探讨掺锶和非掺锶种植体表面对MC3T3-E1成骨前体细胞黏附、增殖和分化的影响。
　　3.通过动物体内植入实验，探讨掺锶和非掺锶种植体周围早期骨组织形态学的改变。
　　研究方法:
　　第一部分 掺锶纯钛种植体表面涂层的构建及理化性能分析
　　首先由威高洁丽康公司精密加工切削出纯钛种植体及钛片并对其表面进行喷砂酸蚀处理，具体方法如下:将纯钛种植体及钛片在5×105Pa的压力下通过高速气流将颗粒直径为25-250μm的研磨材料氧化铝(Al2O3)喷射在种植体表面30s，从而使其表面产生凹陷，然后再利用1∶2比例的热盐酸(HCl)和硫酸(H2SO4)对种植体表面进行酸蚀处理，最终形成不规则的微米级粗糙表面。喷砂酸蚀处理后的种植体及钛片在山东大学材料学院材料学实验室进行磁控溅射处理，具体方法及参数如下:将处理好的种植体及钛片放入磁控溅射仪操作箱，在高浓度氩气流中用纯度为99.99％的钛酸锶靶材在直流电的条件下以功率80W功率作用30min，其中靶材距种植体距离为5.5cm。取出后清洁并干燥后塑封包装，钴60照射消毒后备用。采用扫描电子显微镜观察2组样本的表面形貌;使用X射线光谱分析(EDS)系统分析2组样本表面的化学成分。
　　第二部分 掺锶纯钛种植体表面涂层对成骨细胞生物学行为的影响
　　于上海市中科院购进小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1系，培养含1％链霉素和青霉素、10％胎牛血清的α-MEM培养基中。将消毒好的钛片置于24孔板，MC3T3-E1细胞以2×104个/ml、1ml/孔的密度接种到样品上，置于恒温培养箱中，1d后将其从培养箱中移出，通过激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜对细胞在材料表面的黏附情况及其形态变化进行观察;采用MTT法于1d、3d、5d、7d检测细胞在材料表面的增殖能力;通过碱性磷酸酶半定量、茜素红染色法以及Real-Time PCR骨功能基因检测方法检测成骨细胞在不同材料表面的成骨分化能力。
　　第三部分 掺锶纯钛种植体表面涂层对骨结合的影响
　　选用20只雌性SD大鼠。在每只大鼠两侧后肢靠近胫骨近心端植入，每条后肢随机植入2组种植体各一枚。实验开始前首先用3％水合氯醛进行腹膜内注射麻醉。采用常规方法对实验对象进行消毒、铺巾，在其靠近胫骨端大约2cm处依次将其皮下组织和皮肤切开，将肌肉加以分离，完成后将骨膜切开同时剥除后显露出骨面。使用牙科慢机备洞，用专用携带器将螺纹状种植体旋入窝洞内，保证种植体末端完全进入骨内，全程注射4％生理盐水降温。于植入后第2周和第8周处死大鼠并取材制作硬组织切片。通过组织学分析观察并评估涂层对种植体周围骨结合的影响;采用轴向拔出实验对其生物力学性能进行评估。
　　研究结果：
　　第一部分 掺锶纯钛种植体表面涂层的构建及理化性能分析
　　SEM观察发现，在SLA表面存在一些不规则的孔隙，在直径约为100μm的凹坑状的孔隙上面有直径大小约为1-3μm的突起，其平均粗糙度约为3.2μm。Sr-SLA表面和SLA表面类似，两者孔隙大小和粗糙度未见明显差异。X射线能谱仪测定的图谱结果显示，SLA种植体表面主要含O、Ti峰谱，Sr-SLA组除了原有的O和Ti元素以外，又出现了Sr元素，提示经过钛酸锶靶材磁控溅射处理后种植体表面加载了一定量的Sr元素。经X射线能谱仪定量检测结果显示，SLA表面的O和Ti元素的原子含量分别为19.93％和80.07％，Sr-SLA表面O、Ti、Sr元素的原子含量分别为31.74％、66.08％、2.18％。
　　第二部分 掺锶纯钛种植体表面涂层对成骨细胞生物学行为的影响
　　MC3T3-E1细胞在SLA和Sr-SLA两种钛片表面培养24后，SEM及激光共聚焦显微镜观察发现细胞在SLA和Sr-SLA表面细胞均伸出丝状伪足，在材料表面分散附着，与SLA组相比，Sr-SLA组细胞铺展更加充分;MTT检测结果表明2种样品对成骨细胞增殖活性影响均随着时间的推移逐渐增强。培养第1d、7d，MC3T3-E1细胞在2种材料表面的增殖活性略有不同，但没有统计学意义。培养3、5d后，细胞在Sr-SLA表面的增殖活性显著高于SLA表面。成骨细胞在2种样品表面培养7、14d ALP活性检测结果显示培养7、14d后，细胞在Sr-SLA表面的ALP的表达均显著高于SLA表面。成骨细胞在2种样品表面培养14、28d茜素红染色检测结果显示，MC3T3-E1细胞在SLA和Sr-SLA表面培养14d后，其结果没有统计学差别，并且其矿化活性都比较低。在第28d时，Sr-SLA表面MC3T3-E1细胞的矿化活性明显高于SLA组。Real-Time PCR检测结果表明培养至3、6d时，Runx2及OCN在Sr-SLA表面的表达量略高于SLA表面，但结果无统计学差异，到第9d时两者在Sr-SLA样本表面的表达水平均显著高于SLA组。COLI在3d时2组的表达量差别无统计学意义，6d时2组钛片表面的表达均达到高峰，6d和9d时，COLI在Sr-SLA表面的表达显著高于SLA表面的的表达。
　　第三部分 掺锶纯钛种植体表面涂层对骨结合的影响
　　组织学染色显示两组种植体在植入的第2周、第8周都与骨组织发生紧密的结合，而且在这之中并没有出现炎症反应。并且在大鼠胫骨内，两组种植体表面在植入2周、8周后均有新骨生成，掺锶组新骨生成明显较非掺锶组多，新生骨更具连续性。骨结合率及骨结合面积计量结果显示，2周、8周时掺锶锶组的骨结合率和骨结合面积均高于非掺锶组，但2周时两实组之间无统计学差异，8周时具有统计学差异;2周、8周轴向拔出实验显示掺锶组最大拔出力（Maximum Pull-out force，Fmax）均明显高于非掺锶组。
　　研究结论:
　　1.应用磁控溅射技术，我们成功的在喷砂酸蚀纯钛种植体表面引入了锶元素，从而在种植体表面构建出了新型的掺锶仿生化涂层，并且加掺锶离子的浓度约为2％。
　　2.该新型的掺锶仿生化涂层能够显著促进体外成骨细胞的黏附、增殖和分化，从而更有助于提高成骨细胞的体外生物学活性。
　　3.该新型的掺锶仿生化涂层能够促进体内的早期骨结合从而更有利于种植体周围骨的矿化。

目录

声明

摘要

英文缩略表

前言

第一部分 掺锶纯钛种植体表面涂层的构建及理化性能分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二部分 掺锶纯钛种植体表面涂层对成骨细胞生物学行为的影响

1 材料和方法

2．结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第三部分 掺锶纯钛种植体表面涂层对骨结合的影响

1 材料和方法

2．结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文总结

致谢

博士期间发表论文