刺激响应型MSNs异靶点共递送SF和Tim-3单抗用于肝细胞癌化学免疫联合治疗

摘要

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)严重威胁人类健康。化学治疗是目前HCC治疗最常用手段之一。化学治疗药物索拉非尼(Sorafenib，SF)是首个被美国FDA批准用于晚期HCC治疗的药物，之后被多个临床治疗指南推荐为HCC治疗的一线药物。然而，SF存在一定的免疫抑制作用，其通过诱导肿瘤微环境缺氧，促进T细胞表面免疫检验点的高表达而引起肿瘤免疫逃逸，降低了其临床治疗效果。因此，本课题基于化学免疫联合治疗理念，在SF化学治疗的基础上联用免疫检验点抑制剂，在直接杀伤肿瘤细胞的同时重新激活免疫系统，发挥联合抗肿瘤作用，以提高HCC治疗效果。
　　T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3单克隆抗体(T-cell immunoglobulin and mucin domain3monoclonal antibody，Tim-3mAb)可阻断SF引起的T细胞免疫抑制通路，重新激活T细胞而发挥杀伤肿瘤细胞的作用，是免疫检验点抑制剂领域研究热点。Tim-3mAb与SF的联用能够以不同机制杀伤肿瘤细胞，并缓解SF引起的免疫抑制，改善SF治疗预后，具有良好的HCC治疗前景。然而，SF为水难溶性药物，口服生物利用度低，且存在胃肠道出血等毒副作用;Tim-3mAb为蛋白类药物，不适于口服，亦存在免疫相关毒副作用。二者性质差异大，均存在非期望的药代动力学分布现象，因此需选用合适的药物递送策略对其进行共递送，以协同两种治疗机理，提高疗效。介孔二氧化硅纳米粒（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）具备被动靶向、药物共载以及药物控释等多种功能，为解决上述问题提供了良好的策略。
　　基于上述设计理念，本课题以MSNs为药物载体，设计了两类药物控释系统:①pH响应“开关型”载SF MSNs药物控释系统，②MMP2响应型SF和Tim-3mAb共载MSNs药物控释系统，旨在化学治疗和化学免疫联合治疗两个层面上对HCC进行治疗，以提高HCC治疗效果，降低药物毒副作用。第一层面，选用SF为HCC化疗药物，以生物相容性好且生物可降解的pH敏感材料聚组氨酸(Poly(L-histidine)，PLH)为MSNs的“Gatekeeper”，以聚乙二醇(Poly(ethylene glycol)，PEG)为MSNs亲水“Coating”，设计构建了pH响应“开关型”载SF MSNs药物控释系统(SF/MSNs-PLH-PEG)，用于HCC化学治疗，以提高HCC治疗效果。第二层面，选用SF为HCC化疗药物，Tim-3mAb为HCC免疫治疗药物和“Gatekeeper”，通过基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase2，MMP2)敏感肽将Tim-3mAb连接于MSNs表面，设计构建了MMP2响应型SF和Tim-3mAb共载MSNs药物控释系统(SF/MSNs-pep-Tim-3mAb)，用于HCC化学免疫联合治疗，以实现SF和Tim-3mAb的异靶点共递送，进一步提高HCC治疗效果。
　　本课题主要研究内容及结果如下:
　　1.SF含量测定方法建立
　　使用高效液相色谱法法建立SF含量测定方法，结果表明SF在1～30μg/mL浓度范围内线性良好(R2=0.9999)。日内、日间精密度RSD均小于2％，方法回收率在98％～102％之间且RSD小于2％，符合方法学测定要求。
　　2.pH响应“开关型”载SF MSNs的构建、表征及体内外评价
　　通过溶胶凝胶法合成MSNs，通过溶剂挥发法对MSNs进行载药，通过“graft to”策略将PLH及PEG依次共价修饰于MSNs，制备SF/MSNs-PLH-PEG。通过透射电镜法、电位法、红外光谱法、氮气吸附法、热重分析法以及小角度X射线散射法对其进行系统性表征。结果表明，SF/MSNs-PLH-PEG成功构建;MSNs-PLH-PEG粒径约为160nm;SF/MSNs-PLH-PEG电位为-(13.8±1.7)mV;SF载药量约为(22.5±2.5)％。
　　通过透析袋法考察SF/MSNs-PLH-PEG在不同pH条件下的体外释放行为，SF/MSNs-PLH-PEG中SF在pH5.0条件下的累计释放量显著高于pH7.4(p＜0.01)，表明SF/MSNs-PLH-PEG具有pH敏感释药特性，且随释放介质pH值的改变，SF释放速率也发生明显变化，表明其具有“开关”功能。通过MTT法考察体外细胞毒性，SF/MSNs-PLH-PEG对HepG2细胞具有良好的抗增殖作用，表明其良好的体外抗肿瘤活性。通过抑瘤实验考察体内抗肿瘤效果，SF/MSNs-PLH-PEG组小鼠瘤重低于SF/MSNs组(p＜0.05)，SF/MSNs-PLH-PEG组小鼠体重与生理盐水组相当(p＞0.05)，表明其良好的体内抗肿瘤活性和安全性。溶血试验中，SF/MSNs-PLH-PEG在实验浓度内未出现肉眼可见溶血现象且溶血百分率均小于5％，表明其血液相容性良好。在小鼠主要器官H&E染色实验中，MSNs-PLH-PEG组未发现任何肉眼可见损伤，表明其组织相容性良好。以上实验结果表明SF/MSNs-PLH-PEG具有pH响应“开关”功能、良好的体内外药效以及安全性。
　　3.MMP2响应型SF和Tim-3mAb共载MSNs的构建、表征及体内外评价
　　通过MMP2敏感肽将Tim-3mAb共价修饰于SF/MSNs，制备SF/MSNs-pep-Tim-3mAb。通过透射电镜法、红外光谱法、氮气吸附法、热重分析法以及小角度X射线散射法对其进行系统性表征。结果表明，SF/MSNs-pep-Tim-3mAb成功构建;MSNs-pep-Tim-3mAb粒径约为150nm，电位为-(22.3±1.9)mV;SF载药量为(13.5±3.1)％，Tim-3mAb载药量约（10.1±0.1）％。
　　通过透析袋法和离心法考察SF/MSNs-pep-Tim-3mAb的体外释放行为，SF和Tim-3mAb在含酶条件下的累计释放量显著高于无酶条件(p＜0.01)，表明SF/MSNs-pep-Tim-3mAb具有MMP2敏感释药特性。通过MTT法考察体外细胞毒性，SF/MSNs-pep-Tim-3mAb在HepG2和H22细胞上具有与游离SF相当的细胞毒性，表明其具有良好的体外抗肿瘤活性;通过抑瘤实验考察体内抗肿瘤效果，SF/MSNs-pep-Tim-3mAb组小鼠瘤重低于SF和Tim-3mAb混合溶液组(p＜0.05)，表明其良好的体内抗肿瘤活性。细胞共培养实验中，HepG2对DiI的摄取率显著高于Jurkat细胞(p＜0.01)，而对Tim-3mAb的摄取率显著低于Jurkat细胞(p＜0.01)，说明DiI/MSNs-pep-Tim-3mAb中DiI主要进入肿瘤细胞，而Tim-3mAb主要进入T细胞，表明其具有异靶点药物共递送能力。通过Ki-67染色、H&E染色和Tunel染色进一步评价其体内抗肿瘤效果，结果表明SF/MSNs-pep-Tim-3mAb具有最优的抗肿瘤细胞增殖及促肿瘤细胞凋亡效果。免疫学评价实验中，SF/MSNs-pep-Tim-3mAb可增加免疫促进因子IFN-γ和IL-12的表达，具有缓解SF免疫抑制的作用。溶血实验中，SF/MSNs-pep-Tim-3mAb在实验浓度内未出现肉眼可见溶血现象且溶血百分率均小于5％，表明其血液相容性良好。在主要器官H&E染色实验中，SF/MSNs-pep-Tim-3mAb组未发现任何肉眼可见损伤，表明其组织相容性良好。以上实验结果表明SF/MSNs-pep-Tim-3mAb具有MMP2敏感释药能力、优秀的体内外药效、抗肿瘤细胞增殖及促肿瘤细胞凋亡效果、改善SF免疫抑制的作用以及良好的安全性。
　　综上，本研究基于化学免疫联合治疗的理念，构建刺激响应型异靶点药物共递送系统，同时装载化疗药物与免疫治疗药物。该系统兼具被动靶向、刺激响应型释药、异靶点药物共递送等多种功能，为肿瘤的化学免疫联合治疗提供了新思路、新策略。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

一、肝细胞癌治疗现状

1．肝细胞癌现状

2．肝细胞癌化学治疗

3．肝细胞癌化学免疫联合治疗

二、基于介孔二氧化硅的纳米药物递送系统

2．刺激响应型介孔二氧化硅药物控释系统

三、课题设计思路

第一章 索拉非尼含量测定方法建立

一、实验材料

1． 试剂与药品

2．主要仪器

二、实验方法

2．色谱条件选择

3．专属性考察

6．精密度考察

7．方法回收率考察

三、结果与分析

1．检测波长确定

2．专属性考察结果

3．检测限与定量限确定

4．标准曲线建立

5．精密度考察结果

6．方法回收率考察结果

四、讨论

五、本章小结

第二章 pH响应“开关型"载SF MSNs的构建、表征及体内外评价

一、实验材料

1．试剂与药品

3．试剂配制

4．细胞与动物

2．载体表征及理化性质考察

3．体外稳定性考察

4．pH响应体外释放实验

5．体外细胞毒性实验

6．体外细胞摄取实验

7．小鼠肝癌模型建立

8．体内抑瘤实验

9．安全性考察

10．统计学分析

三、结果与分析

1．载体构建及载药量测定

2．载体表征及理化性质评价

3．体外稳定性评价

4．pH响应体外释放评价

5．体外细胞毒性评价

6．体外细胞摄取评价

7．体内抑瘤效果评价

8．安全性评价

四、讨论

五、本章小结

第三章 MMP2响应型SF和Tim-3 mAb共载MSNs的构建、表征及体内外评价

一、实验材料

1．试剂与药品

2．主要仪器

3．试剂配制

4．细胞与动物

二、实验方法

1．载体构建及载药量测定

2．载体表征及理化性质考察

4．MMP2响应体外释放实验

5．体外细胞毒性实验

6．异靶点共递送实验

7．小鼠肝癌模型建立

8．体内抑瘤实验

9．体内肿瘤细胞增殖及凋亡考察

10．细胞因子测定实验

11．安全性考察

12．统计学分析

1．载体构建及载药量测定

2．载体表征及理化性质评价

3．MMP2敏感肽酶敏感性评价

4．MMP2响应体外释放评价

5．体外细胞毒性评价

6．异靶点共递送评价

7．体内抑瘤效果评价

8．体内肿瘤细胞增殖及凋亡评价

9．免疫学评价

10．安全性评价

四、讨论

五、本章小结

一、全文结论

二、创新点

三、展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文