长链非编码RNA MALAT1通过microRNA--19b抑制脂多糖诱导ATDC5细胞损伤的作用机制

摘要

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨细胞减少、关节基质破坏为主要病理改变慢性骨关节疾病，是导致中老年人疼痛和残疾的最常见原因之一。流行病学调查显示中国40岁以上中老年人膝关节骨关节炎总患病率为17.0％，患病率随年龄增长而增加，65岁以上老龄人口患病率可达60-70％。由于老龄化人口的增加，骨关节炎已成为影响人类健康的世界性的问题。研究发现多种因素可导致关节软骨退变，包括年龄、肥胖、劳损、创伤和炎症等。骨关节炎的发病机制仍在不断完善中，越来越多的研究证明，免疫反应参与了骨关节炎的发病，包括细胞免疫、体液免疫异常、自身免疫相关信号通路激活等。关节软骨退变的机制需要更多的临床和实验研究进行探讨。 研究目的： 本研究旨在探讨长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录因子1(lncRNA MALAT1)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠软骨祖细胞(ATDC5)炎症损伤的影响，并探讨其可能机制。 研究方法： 1、LPS诱导ATDC5细胞凋亡和炎性损伤。 在DMEM/F12中培养ADTC5细胞，应用LPS进行处理。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测定不同浓度LPS处理后的ATDC5细胞活性。采用AnnexinV-PE染色法检测不同浓度LPS处理后的ATDC5细胞凋亡。应用Western blotting方法检测不同浓度LPS处理后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Pro-caspase3、Cleaved-caspase3、Pro-caspase9和Cleaved-caspase9的表达。分别用定量逆转录PCR(qRT-PCR)和Western blotting方法检测LPS处理后ATDC5细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表达。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测LPS处理后ATDC5细胞培养上清中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。 2、LPS处理后ATDC5细胞中MALAT1的表达。 用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LPS处理后ATDC5细胞中MALAT1的表达。 3、MALAT1对LPS诱导的ATDC5细胞炎性损伤的作用。 用pEX-MALAT1和shMALAT1转染LPS处理后的ATDC5细胞。分别用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法和AnnexV-pe染色法检测LPS处理pEX-MALAT1和sh-MALAT1转染后ATDC5细胞活性和凋亡率。用qRT-PCR检测ATDC5细胞中MALAT1的表达。设立对照组、LPS处理组、LPS+pEX组、LPS+pEX+MALAT1组和LPS+shNC组、LPS+sh+MALAT1组。Western blotting方法分别检测各组Bcl-2、Bax、Pro-caspase3、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Pro-caspase9的表达，用qRT-PCR和Western blotting检测各组ATDC5细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表达。ELISA法检测上清液中的IL-1β，IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。 4、MALAT1对ATDC5细胞中miR-19b表达的调控。 转染pEX-MALAT1或sh-MALAT1后，用qRT-PCR方法检测转染后ATDC5细胞中miR-19b的表达。 5、MALAT1通过miR-19b调控LPS诱导ATDC5细胞的炎症损伤。 用miR-19b抑制剂转染ATDC5细胞。采用qRT-PCR法检测转染miR-19b抑制剂后ATDC5细胞中miR-19b的表达。分别用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、Annexinv-pe染色和Western印迹法检测ATDC5细胞活性、细胞凋亡及Bcl-2、Bax、Pro-caspase3、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Pro-caspase9的表达。分别采用定量逆转录PCR(qRT-PCR)、Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测ATDC5细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-A mRNA和蛋白的表达，以及ATDC5细胞培养上清中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。 6、MALAT1与ATDC5细胞中Wnt/β-catenin和NF-κ B信号通路相关性。 应用Western blotting分析转染miR-19b抑制剂后对照组、LPS组、LPS+pEX+NC组、LPS+pEX-MALAT1+NC组和LPS+pEX-MALAT1+miR-19b抑制剂组ATDC5细胞中Wnt3α、β-catenin、t-Iκ Bα、p-Iκ B、t-p65和p-p65的表达。 研究结果： 1、LPS诱导ATDC5细胞凋亡和炎性损伤 LPS能够明显抑制ATDC5细胞活性，且具有剂量依赖性。2.5μ g/ml或5μg/ml LPS处理后，细胞凋亡率均升高，5μ g/ml LPS处理后的凋亡率明显高于2.5μ g/ml LPS。LPS能够上调ATDC5细胞Bax、Pro-caspase3、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Pro-caspase9，下调Bcl-2的表达，且5μ g/ml作用强于2.5μ g/ml。LPS能够显著增加IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达。 2、LPS刺激ATDC5细胞中MALAT1的表达上调。 经2.5μ g/ml及5μ g/ml LPS处理后，ATDC5细胞中MALAT1的表达上调。 3、MALAT1对LPS诱导的ATDC5细胞炎性损伤的保护作用 转染pEX-MALAT1可显著增加ATDC5细胞中MALAT1的表达，而sh-MALAT1则显著降低了MALAT1的表达。转染pEX-MALAT1能显著抑制LPS处理ATDC5细胞出现的活性抑制和凋亡增加，而sh-MALAT1转染则出现与之相反效应。转染pEX-MALAT1还能够抑制LPS诱导的Bax、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9的表达增加以及Bcl-2的表达下降，而sh-MALAT1转染则使bcl-2的表达下降。此外，pEX-MALAT1转染后降低了LPS诱导的ATDC5细胞上清液中的IL-1β，IL-6、IL-8和TNF-α的浓度，而转染sh-MALAT1则使其浓度升高。 4、MALAT1对ATDC5细胞miR-19b表达呈正向调控作用。 转染pEX-MALAT1显著上调了ATDC5细胞中miR-19b的表达。而sh-MALAT1转染明显下调了ATDC5细胞miR-19b的表达。 5、MALAT1通过上调miR-19b减轻LPS诱导的ATDC5细胞炎症损伤。 转染miR-19b抑制剂后，ATDC5细胞中miR-19b的表达明显降低。转染miR-19b抑制剂后，MALAT1对LPS诱导的ATDC5细胞活性抑制和凋亡诱导的保护作用显著下降。与LPS+pEX-MALAT1组相比，LPS+pEX-MALAT1+miR-19b抑制剂组Bax、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9的表达增加，Bcl-2表达降低。此外，miR-19b抑制剂转染可逆转pEX-MALAT1对LPS诱导的ATDC5细胞促炎细胞因子表达的影响。 6、MALAT1通过上调miR-19b抑制LPS诱导的ATDC5细胞Wnt/β-catenin和NF-κ B通路的激活。 LPS通过上调ATDC5细胞Wnt3α、β-catenin、p-Iκ Bα和p-p65的表达显著激活ATDC5细胞Wnt/β-catenin和NF-κ B通路。pEX-MALAT1转染可通过下调LPS诱导的Wnt3α、β-catenin、p-Iκ Bα和p-p65的表达，从而显著逆转LPS诱导的ATDC5细胞Wnt/β-catenin和NF-κ B通路的激活。miR-19b抑制剂转染能明显逆转pEX-MALAT1对LPS诱导的Wnt/β-catenin和NF-κ B通路的激活作用。 研究结论： LPS显著诱导ATDC5细胞凋亡及炎症损伤。在LPS处理的ATDC5细胞中MALAT1表达升高。MALAT1过度表达显著抑制LPS诱导的ATDC5细胞炎症损伤，抑制MALAT1得到相反的效果。进一步研究结果表明，MALAT1对ATDC5细胞表达miR-19b具有正向调节作用。下调miR-19b明显逆转MALAT1对LPS处理的ATDC5细胞的保护作用。此外，MALAT1通过上调miR-19b抑制LPS诱导的ATDC5细胞WNT/β-catenin和NF-κ B通路的激活。 实验结果表明，miR-19b在MALAT1对LPS诱导的ATDC5细胞炎症损伤的保护作用中起关键作用，MALAT1通过上调miR-19b的表达减轻LPS诱导的ATDC5细胞炎症损伤。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分MALAT1与LPS诱导ATDC5细胞损伤的相关性研究

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、小结

附图

第二部分MALAT1通过microRNA-19b抑制LPS诱导ATDC5细胞损伤机制的研究

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、小结

附图

第三部分MALAT1上调microRNA-19b减轻LPS诱导ATDC5细胞损伤的信号传导通路的研究

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、小结

附图

结论

参考文献

致谢

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