长链非编码RNAlncRNA-5657在脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中的功能及机制研究

摘要

目的： 越来越多研究表明 lncRNA广泛参与机体各种生理和病理过程，其表达紊乱与多种人类重大疾病的发生发展密切相关。本研究筛选出LPS刺激AM前后差异表达最明显的lncRNA-5657，观察AM炎症反应时其动态表达变化，探讨其调控AM炎症反应的作用及可能的机制。 方法： （1）体外培养NR8383细胞，以终浓度1μg/ml的LPS刺激细胞构建AM炎症反应模型，采用 ELISA检测细胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白含量，以确定模型构建成功；采用lncRNA高通量测序技术检测LPS刺激前后细胞中lncRNA表达谱的变化，筛选出差异表达的与AM炎症相关 lncRNAs进行分析。 （2）采用RT-qPCR检测LPS刺激AM后lncRNA-5657的动态表达；使用核质分离试剂盒分别抽提AM细胞核和细胞质的RNA，采用RT-qPCR检测细胞核和细胞质中lncRNA-5657的表达，以明确lncRNA-5657的亚细胞定位。 （3）构建lncRNA-5657过表达慢病毒载体后感染AM，荧光显微镜下观察荧光量确定感染效率；针对lncRNA-5657的序列特异性设计合成lncRNA smart sliencer后转染AM；采用RT-qPCR检测lncRNA-5657及细胞中炎症因子的表达变化，采用ELISA检测上清液中炎症因子蛋白含量变化，以明确lncRNA-5657对AM炎症反应的影响。 （4）生物信息学分析预测lncRNA-5657的靶基因并筛选验证，在AM中分别过表达和沉默lncRNA-5657，采用RT-qPCR、western blot检测细胞中spns2 mRNA及蛋白的改变；采用 ELISA检测向 AM中转染 si-spns2或过表达lncRNA-5657的同时转染 si-spns2后上清液中炎症因子蛋白含量变化，以明确lncRNA-5657参与调控AM炎症反应的机制。 结果： （1）LPS刺激AM6、12、24h后，上清液和细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白及mRNA含量均逐渐升高,12h达到高峰，24h下降，但仍高于正常对照组，表明AM炎症反应模型构建成功；以LPS刺激组与空白对照组表达比值≥2倍且P＜0.05作为差异表达lncRNA，LPS刺激AM6h后差异表达lncRNA共有904条，其中上调2倍以上的lncRNA共591条，下调2倍以上的lncRNA共313条，表明lncRNA的表达变化与AM炎症反应相关。 （2）LPS刺激6、12、24h后，lncRNA-5657表达水平逐步上调，表明lncRNA-5657与AM炎症反应密切相关；核质分离结果表明lncRNA-5657绝大部分位于细胞核中。 （3）lncRNA-5657慢病毒感染细胞72h后，在荧光显微镜下观察到绿色荧光，lncRNA-5657表达明显上调，LPS诱导后的TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白的表达也明显上调；lincRNA-5657 smart silencer转染细胞72h后， lncRNA-5657表达明显下调，LPS诱导后的TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白的表达也明显下调，表明lncRNA-5657参与调控了AM炎症反应。 （4）筛选出lncRNA-5657的靶基因spns2，过表达lncRNA-5657后，细胞中spns2的表达上调，沉默lncRNA-5657后，spns2的表达下调；LPS刺激AM6、12、24h后，细胞中spns2蛋白表达逐步上调，48h下降，但仍高于正常对照组；干扰 spns2表达后 TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白分泌明显减少；过表达lncRNA-5657后再干扰spns2炎症因子分泌仍减少，表明lncRNA-5657可通过调控spns2的表达从而调控AM炎症反应。 结论： LPS诱导AM炎症反应后，lncRNA表达谱发生显著变化，LPS刺激 AM后lncRNA-5657表达上调，沉默lncRNA-5657可减轻LPS诱导的AM炎症反应，其机制可能为以顺式调控的方式靶向调控spns2的表达，减少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的释放，从而抑制AM炎症反应。

目录

声明

主要英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞株

2.1.2 实验主要试剂

2.1.3 实验仪器与设备

2.2 实验器材的准备与主要试剂的配制

2.2.1 细胞培养耗材的处理

2.2.2 细胞培养基的配制

2.2.3 LPS、琼脂糖凝胶的配制

2.2.4 western blot 相关试剂的配制

2.3实验方法

2.3.1 细胞复苏、培养、传代及冻存

2.3.2 实验分组

2.3.3 ELISA

2.3.4 细胞核和细胞质的分离

2.3.5 总RNA的提取与RT-qPCR

2.3.6 慢病毒感染

2.3.7 细胞转染

2.3.8 western blot

2.3.9 统计学处理

第3章 结果

3.1 LPS诱导AM炎症反应后lncRNA的筛选

3.1.1 LPS诱导AM炎症反应模型的构建

3.1.2 LPS刺激AM后lncRNA表达变化

3.2 lncRNA-5657在LPS诱导的AM炎症模型中的动态表达变化及其亚细胞定位

3.2.1 lncRNA-5657在LPS诱导的AM炎症模型中的动态表达变化

3.2.2 lncRNA-5657的亚细胞定位

3.3 过表达或沉默lncRNA-5657对LPS诱导的AM炎症的影响

3.3.1 过表达lncRNA-5657增强LPS诱导的AM炎症反应

3.3.2 沉默lncRNA-5657可抑制LPS诱导的AM炎症反应

3.4 lncRNA-5657调控AM炎症反应的机制

3.4.1 lncRNA-5657靶向作用于spns2

3.4.2 spns2对LPS诱导的AM炎症反应的影响

3.4.3 lncRNA-5657调控LPS诱导的AM炎症反应依赖于spns2

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 进一步工作的方向

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: lncRNA在脓毒症肺损伤中的研究进展