基于MHCⅠ类分子标记的青海地区狼适应性进化及遗传多样性研究

摘要

狼（Canis lupus）是一种适应能力极强的陆生哺乳动物，进化到现在，它是全球最成功的集群狩猎的食肉动物之一。狼曾经是分布最为广泛的陆栖野生哺乳动物。由于狼对人类的家畜和畜牧业造成了巨大威胁，再加上人类对犬科动物毛皮的迷恋，使它们遭到人类捕杀；而且随着人类社会的发展，经济开发不断扩张，狼群栖息地不断地缩小或丧失等，使得狼的数量日渐减少，许多分布区已近绝迹。在我国，狼主要分布在人烟稀少的内蒙古、青海、新疆、西藏等地区。
　　主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）是脊椎动物基因组中多态性极高的功能性基因家族之一，所编码的蛋白质分子具有呈递抗原并激发免疫反应而使物种世代维持其应对环境变化能力的功能，为迄今开展脊椎动物环境适应性进化的主要分子标记。其中，MHC第一家族的基因具有自己独特的进化历史和多态性维持机制，使它成为评估野生动物种群遗传结构、环境适应能力和疾病抵抗潜力的重要指标。但是，在中国狼身上未开展过有关MHCⅠ类基因的研究，甚至在全世界有关MHCⅠ类分子标记狼的研究也是鲜有报道。本研究对分布于中国青海省的野生狼种群的样品进行了Ⅰ类MHC分子标记的探索，通过对四个具有研究价值的结构完整的犬科动物MHC第一家族基因的分离和遗传变异分析，主要得到了以下结果：
　　（1）采用克隆和PCR产物测序技术得到了DLA-88、DLA-12、DLA-79和DLA-64的基因序列。拼接DLA-88外显子2和外显子3得到了长度为549bp的整合序列，筛选比对后得到了37条独特序列，通过分型共定义了24个DLA-88等位基因。并且，24个等位基因全部是新发现的，不同于已知的71个家犬DLA-88等位基因。同样的方法，DLA-12基因共定义了16个等位基因，其中12个等位基因仅在狼中发现，另外4个狼和家犬共有；DLA-79基因也定义了16个等位基因，仅在狼中发现；DLA-64基因定义了2个等位基因且和家犬是共享的。
　　（2）研究发现犬科动物MHCⅠ类基因的碱基组成非常特别——蛋白质编码序列GC含量非常高。DLA-88外显子2和外显子3 G+C含量为68.6％，远高于含量为31.4%的A+T。密码子第一位GC含量为63.8%，密码子第二位GC含量为50.8%，密码子第三位GC含量高达91.4%。DLA-12外显子2和外显子3 GC含量为68.7%，高于含量为31.4%的A+T。密码子第一位GC含量63.9%，密码子第二位GC含量51.0%，密码子第三位GC含量91.2%。DLA-79外显子2和外显子3 GC含量为64%，高于含量为36%的A+T。密码子第一位GC含量62.9%，密码子第二位GC含量47.6%，密码子第三位GC含量81.5%。DLA-64外显子2和外显子3 GC含量为68.6%，高于含量为31.5%的A+T。密码子第一位GC含量65.6%，密码子第二位GC含量47.8%，密码子第三位GC含量92.3%。
　　（3）犬科动物MHC经典Ⅰ类基因——DLA-88呈现出高度的多态性。青海地区狼DLA-88外显子2和外显子3的序列共发现78个变异位点，占序列总长度的14.2%，单一多态位点19个，简约信息位点59个。核苷酸多样性指数为0.03370，单倍型多样性指数为0.937。相应的，MHC非经典Ⅰ类基因——DLA-12、DLA-79、DLA-64则不如经典Ⅰ类基因多态，这也就符合了前人对经典基因和非经典基因的定义。
　　（4）通过将24条新发现青海地区狼的DLA-88等位基因与另外六种已知序列的家犬作群体遗传学分析发现，种内遗传距离大小顺序为 Basenji> Gold Retriever>Beagle>Boxer>Canis lupus filchneri>Harrier>Greyhound。作种间遗传距离分析发现，遗传距离最大的是贝吉生犬和格雷猎犬，最小的是哈利犬和格雷猎犬。青海地区狼与贝吉生犬的遗传距离最大，其次是金毛寻回犬，和哈利犬的遗传距离最小。
　　（5）青海地区狼和六种家犬的DLA-88外显子2和外显子3总位点dN/dS>1，存在正选择且差异极显著。青海地区狼的PBR位点和非PBR位点dN/dS>1，但是PBR位点存在正选择差异极显著，非PBR位点存在正选择差异不显著。青海地区狼的DLA-12基因总位点dN/dS>1存在正选择且差异极显著，DLA-79基因总位点dN/dS>1存在正选择且差异显著。青海地区狼的MH C经典Ⅰ类基因和非经典Ⅰ类基因的变异都不是中性的，它们遭受了自然选择压力而存在正选择。
　　（6）构建犬科动物目前所有已知的 DLA-88等位基因的最大似然树与贝叶斯树，发现两者基本一致。而且，24个狼的等位基因型分散于不同类型家犬的等位基因型中，在一定程度上，反映了MH C基因的跨物种进化。

目录

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本研究承蒙以下项目基金支持

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目录

第一章 文献综述

1.1 青海省自然概况

1.2 狼的研究概述

1.2.1 犬科动物简介

1.2.2 狼的简介

1.2.3 狼的研究进展

1.3 MHC研究的综述

1.3.1 MHC的分类和结构

1.3.2 MHC的功能

1.3.3 MHC的特点

1.3.4 MHC多态性机制的探讨

1.3.5 当前MHC的研究进展

1.3.6 MHC研究的意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2实验设备和试剂

2.2.1 实验设备

2.2.2 实验试剂

2.3实验流程

2.3.1 DNA提取

2.3.2 引物设计

2.3.3 PCR扩增与回收

2.3.4 连接与转化

2.3.5 阳性克隆筛选扩增与测序

2.3.6 数据分析方法

第三章 实验结果与分析

3.1 DLA-88基因实验结果与分析

3.1.1 扩增结果的检验

3.1.2 碱基组成

3.1.3 多态位点变异及多样性分析

3.1.4 等位基因的分型和分布

3.1.5群体遗传学分析

3.1.6 氨基酸方面分析

3.1.7 同义替换和非同义替换

3.1.8 系统发生树的构建

3.2 非经典基因实验结果与分析

3.2.1扩增结果的检验

3.2.2 碱基组成

3.2.3 多态位点变异及多样性分析

3.2.4 等位基因的分型和分布

3.2.5 氨基酸变异分析

3.2.6 同义替换和非同义替换

第四章 讨论与结论

4.1 MHC研究方法的探讨

4.2 青海地区狼MHCⅠ类等位基因的多样性水平

4.3 青海地区狼MHCⅠ类基因密码子使用频率的分析

4.4 青海地区狼MHCⅠ类基因的正选择和平衡选择

4.5 青海地区狼的保护策略和展望

参考文献

致谢