siRNA靶向沉默Notch1基因对T细胞淋巴瘤细胞Notch1/c-Myc信号通路影响的研究

摘要

目的:
　　探讨siRNA靶向沉默Notch1基因对T细胞淋巴瘤细胞的增殖及凋亡作用的影响，以及对T细胞淋巴瘤细胞Notch1/c-Myc信号通路的影响。
　　方法:
　　选取Jurkat细胞作为T细胞淋巴瘤模型，取对数生长期的细胞进行如下实验研究。提取DNA进行Notch1基因的外显子27、34进行测序，测定其突变位点，利用RNA干扰技术（RNAi）合成两段小干扰RNA序列（siRNAⅠ和siRNAⅡ）靶向沉默Notch1基因。在进行细胞转染72h之后，利用共聚焦显微镜观看转染的绿色荧光（慢病毒携带），然后用嘌呤霉素筛选成功转染的稳定的细胞株（慢病毒载体携带抗嘌呤霉素基因）。用筛选好的转染成功的Jurkat细胞进行该实验研究。每项试验至少重复三次。利用CCK-8法分析转染后的Jurkat细胞的活力；分别提取Jurkat细胞总RNA和总蛋白，进行实时荧光定量PCR（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western Blot）检测Notch1及其靶基因c-Myc和凋亡基因Caspase3 mRNA和蛋白相对表达水平；并利用流式细胞术检测siRNA靶向沉默Notch1基因对Jurkat细胞凋亡的影响。利用单因素方差分析对所有的数据进行统计学分析，P＜0.05则认为具有明显差异。
　　结果:
　　1.siRNA转染组Ⅰ细胞增殖能力下降（0.472?0.202），与细胞对照组和siRNA阴性对照组相比，均具有统计学显著差异（P=0.000，P=0.001)；siRNA转染组Ⅱ增殖能力下降（0.468?0.063），与细胞对照组和siRNA阴性对照组相比，均具有统计学显著差异（P=0.000，P=0.001)；
　　2.siRNA转染组Ⅰ细胞凋亡明显增加（25.170?1.756），与细胞对照组和siRNA阴性对照组相比具有统计学差异（P=0.000，P=0.000)，siRNA转染组Ⅱ细胞凋亡增加（7.300?0.600），与细胞对照组和siRNA阴性对照组相比具有统计学差异（P=0.002，P=0.002)；siRNA转染组Ⅰ和siRNA转染组Ⅱ相比较具有统计学差异（P=0.000）；
　　3.siRNA转染组Ⅰ Notch1、c-Myc mRNA表达水平下降（0.090?0.000、0.267?0.012），与细胞对照组相比均具有统计学显著差异（P=0.000，P=0.000），与siRNA阴性对照组相比具有统计学显著差异（P=0.000，P=0.000），Caspase3 mRNA表达水平增加（2.490?0.713），与细胞对照组和siRNA阴性对照组相比具有统计学显著差异（P=0.004，P=0.005)；siRNA转染组ⅡNotch1、c-Myc mRNA表达水平下降（0.233?0.006、0.327?0.045），与细胞对照组相比均具有统计学显著差异（P=0.000，P=0.000），与siRNA阴性对照组相比具有统计学显著差异（P=0.000，P=0.000），Caspase3 mRNA表达水平增加（2.217?0.204），与细胞对照组和siRNA阴性对照组相比具有统计学显著差异（P=0.011，P=0.014)；
　　4.siRNA转染组ⅠNotch1、c-Myc蛋白表达水平下降（0.713?0.065、0.718?0.125），与细胞对照组相比均具有统计学显著差异（P=0.000，P=0.014），与siRNA阴性对照组相比具有统计学显著差异（P=0.000，P=0.020），Caspase3蛋白表达水平增加（1.245?0.033），与细胞对照组和siRNA阴性对照组相比具有统计学显著差异（P=0.000，P=0.001)；siRNA转染组ⅡNotch1、c-Myc蛋白表达水平下降（0.897?0.175、0.871?0.125），与细胞对照组相比均具有统计学显著差异（P=0.000，P=0.021），与siRNA阴性对照组相比具有统计学显著差异（P=0.000，P=0.030），Caspase3蛋白表达水平增加（1.149?0.096），与细胞对照组和siRNA阴性对照组相比具有统计学显著差异（P=0.001，P=0.001)。
　　结论:
　　siRNA靶向沉默Notch1基因可以显著抑制Notch1/c-Myc信号通路的传导，抑制Jurkat细胞生长，提高凋亡率。

目录

引言

材料和方法

1 实验材料

2 细胞培养

3 Notch1基因DNA测序

4 siRNA靶向Notch1干扰序列进行细胞转染

5 细胞增殖检测

6 细胞凋亡的检测

7实时荧光定量PCR（RT-PCR）

8免疫印迹技术（Western blot）分析

9 数据统计分析

结果

1 Jurkat细胞Notch1基因突变位点

2 siRNA靶向沉默Notch1基因对T细胞淋巴瘤细胞增殖的影响

3 siRNA靶向沉默Notch1基因对T细胞淋巴瘤细胞凋亡的影响

4 siRNA靶向沉默Notch1基因对T细胞淋巴瘤细胞Notch1、c-Myc、Caspase3 mRNA相对表达水平的影响

5 siRNA靶向沉默Notch1基因对T细胞淋巴瘤细胞Notch1、c-Myc、Caspase3蛋白相对表达水平的影响

讨论

结论

参考文献

综述：siRNA靶向Notch1基因对肿瘤细胞作用的研究进展

攻读学位期间的研究

致谢

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