蒙古马免疫相关基因表达研究及脾脏表达谱分析

摘要

中国马业正处在从传统马业向现代马业转型的过程中，急需培育出适应我国自然环境的马匹新品种（系）。为此，对优良地方品种蒙古马免疫相关基因进行研究，不但可以进一步了解蒙古马抗病力强的原因，为揭示蒙古马抗病力遗传特性提供理论依据，而且可以对蒙古马种质资源的保护、利用和创新起到积极的作用，并指导地方品种马的杂交改良、品种（系）的培育。本研究以蒙古马为研究对象，以纯血马为对照，首先对蒙古马与纯血马血液生化、免疫和抗氧化指标进行测定分析，判断正常生理情况下，蒙古马与纯血马血液指标是否存在差异，从总体上掌握两个品种马抗病力的情况；其次，对马匹抗病候选基因TLR2、TLR4多态性进行研究，分析两个品种马基因型的差异性；再次，采用实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）的相对定量方法对两个品种马不同组织中TLRs基因的表达量进行差异分析，同时对在脂多糖（LPS）诱导下的两个品种马单核细胞与免疫相关基因的差异表达进行研究，得到各基因的相对表达量，进而分析免疫相关基因对不同品种间抗性的影响；最后，利用高通量测序技术对蒙古马与纯血马脾脏表达谱文库进行测序，以寻找两个品种马脾脏组织中的差异表达基因。通过本研究的结果可以为揭示蒙古马抗病力遗传特性提供理论依据，并获得以下主要研究结果：
　　1．通过对血液生化、免疫和抗氧化指标的结果分析发现，纯血马血液中白蛋白和胆固醇的含量偏高，这与其饲料营养水平相一致；蒙古马血液中球蛋白、IgG和IgA的含量均显著高于纯血马（P＜0.05），推测与蒙古马的免疫力高有关。
　　2．采用PCR-SSCP技术对蒙古马与纯血马TLR2基因进行分型，两个群体都呈现出三种基因型（AA、AB和BB型）；经测序发现该基因外显子存在两处突变：编码区945bp位置G→C的同义突变和1070bp位置G→A的错义突变；由于密码子的摆动性，945bp位置并未导致精氨酸的突变；而1070bp位置由精氨酸突变为谷氨酰胺。对基因型统计分析，蒙古马与纯血马品种之间不同基因型分布存在显著差异（0.01≤P＜0.05）。
　　3．通过直接测序方法发现，蒙古马与纯血马TLR4基因第3外显子共发现11处碱基突变，其中8处（520bp位置T→G，668bp位置A→G，817bp位置C→T，1003bp位置C→T，1513bp位置T→C，1546bp位置G→A，1771bp位置T→C和1903bp位置T→C）为同义突变；其他3处，713bp位置C→A导致谷氨酰胺变为赖氨酸，1353bp位置T→C使甲硫氨酸变为苏氨酸，1673bp位置A→G导致甲硫氨酸变为缬氨酸，并且这3处不同基因型分布存在极显著差异（P＜0.01）。
　　4．采用RT-qPCR的2-△Ct方法对蒙古马与纯血马TLR1-9基因在肝脏、脾脏、肺脏、盲肠和骨髓组织进行了差异表达研究。结果表明各基因在5个组织中均有表达；TLRs基因在免疫器官（脾脏和骨髓）中的表达量为蒙古马高于纯血马；而在肝脏中为蒙古马低于纯血马。
　　5．马外周血单核细胞经LPS刺激后，无论是蒙古马还是纯血马TLR4、CD14、MD-2、TNF-α、INF-β、IL-1β、IL-6和IL-8基因表达量都有所增加（与对照组相比）；TLR4、CD14、IL-1β、IL-6和IL-8基因的表达量均是蒙古马低于纯血马，其中TLR4基因和 IL-1β基因表达差异显著（P＜0.05）。单核细胞上清液中细胞因子（TNF-α、INF-β、IL-1β和IL-8）含量在两个品种之间差异不显著（P≥0.05）。
　　6．构建了蒙古马-脾脏和纯血马-脾脏组织表达谱文库，经Illumina Miseq高通量测序，分别获得了6811804和7744386有效reads；两个文库Map到8号和1号染色体的reads最多，而Map到29号、30号和31号染色体的reads最少；两个文库共筛出279个差异表达基因，其中与免疫相关的基因有45个。GO功能富集分析结果表明差异表达基因与生物学过程、细胞组分和分子功能有关；KEGG通路富集分析结果表明差异最大的显著富集KEGG条目为免疫系统。

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插图和附表清单

缩 略 词 表

1 引言

1.1 蒙古马与纯血马品种间抗病力差异

1.2 抗病力与抗病育种

1.3 马免疫系统概述

1.4 Toll样受体概述

1.5 免疫学检测方法及免疫相关基因研究技术手段

1.6 本研究的目的、意义及主要研究内容

2 实验一 蒙古马血液生化、免疫和抗氧化指标的检测

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

3 实验二 蒙古马TLR2、TLR4基因多态性分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

4 实验三 蒙古马不同组织TLRs mRNA转录水平研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

5 实验四 LPS诱导蒙古马单核细胞免疫相关基因的表达

5.1 实验材料

5.2 实验步骤

5.3 结果与分析

5.4 讨论

6 实验五 蒙古马-脾脏与纯血马-脾脏差异表达基因的筛选

6.1 实验材料

6.2 实验步骤

6.3 结果与分析

6.4 讨论

7 全文总体结论、创新点及进一步研究的问题

7.1 结论

7.2 创新点

7.3 进一步研究的问题

致谢

参考文献

附 录

作 者 简 介