mTORC1在金黄色葡萄球菌及其肽聚糖诱导炎性反应中的作用与机制

摘要

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种典型的革兰氏阳性细菌，作为一种环境致病菌可引起群体感染。金黄色葡萄球菌可引起奶牛乳腺炎，造成奶牛产奶量下降，导致养殖业严重的经济损失。肽聚糖是金黄色葡萄球菌细胞壁的主要成分，作为一种重要的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，是模式识别受体Toll样受体2(toll like receptor2，TLR2)的配体。肽聚糖与TLR2结合，导致TLR2胞内TIR结构域结合并激活MyD88(myeloid differentiation88)，进而募集IRAK(IL-1-receptor kinase)和TRAF6(TNF-receptor-associatedfactor6)，激活NF-κB(transcription factor nuclear factor，NF-κB)等转录因子，诱导炎性因子表达，引起炎症反应。
　　mTOR（mammalian target of rapamycin）是进化上十分保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于PIKK(phosphatidyl-inositol3-kinase-related kinase)超家族，在细胞内与其它蛋白组成mTORC1(mTOR complex1)和mTORC2(mTOR complex2)两种复合体。其中mTORC1对rapamycin敏感，在天然免疫反应中具有重要作用，但mTORC1是否调控金黄色葡萄球菌及其肽聚糖诱导的炎性反应目前还不清楚。本研究选择小鼠巨噬细胞和牛乳腺上皮细胞为研究对象，首先以金黄色葡萄球菌肽聚糖作为病原相关分子模式配体作用于小鼠巨噬细胞，探讨mTORC1在调控肽聚糖诱导炎性因子的表达及巨噬细胞增殖中的作用;进而以金黄色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮细胞，通过比较蛋白质组学研究筛选出与细菌侵染相关的蛋白分子和信号转导通路，并探讨mTORC1在这一过程中的调控作用。旨在将病原相关分子模式（肽聚糖）和病原体侵染（金黄色葡萄球菌）在诱导炎性反应中的作用相互参照，以证明mTORC1在调控金黄色葡萄球菌及其肽聚糖诱导的炎性反应中的关键性作用及机制。
　　本论文由两部分组成:第一部分以金黄色葡萄球菌的肽聚糖(peptidoglycan，PGN)刺激小鼠巨噬细胞Ana-1，观察肽聚糖对Ana-1细胞增殖的作用，检测肽聚糖诱导Ana-1细胞分泌炎性因子（TNF-α，IL-6和IL-10）情况，以证明肽聚糖具有诱导小鼠巨噬细胞分泌炎性因子的作用。同时使用mTORC1特异性抑制剂rapamycin处理细胞，检测mTORC1信号通路被抑制后肽聚糖诱导Ana-1细胞分泌炎性因子的变化情况，以证明mTORC1对肽聚糖诱导小鼠巨噬细胞分泌炎性因子具有调控作用。结果表明:(1)肽聚糖刺激巨噬细胞表达TNF-α，IL-6和IL-10，且具有时间和剂量依赖性。刺激Ana-1细胞最佳浓度和时间分别为25μg/ml/6 hr;(2)使用rapamycin处理细胞抑制mTORC1活性后，肽聚糖诱导的细胞增殖和炎症因子TNF-α，IL-6分泌减弱，而抑炎因子IL-10分泌增强。说明mTORC1在调控肽聚糖诱导的炎性因子分泌中，对炎症因子TNF-α，IL-6和抑炎因子IL-10可能具有不同的调控机制。
　　为探讨mTORC1调控肽聚糖诱导的巨噬细胞炎性因子表达的分子机制，我们对mTOR信号通路和炎性因子基因表达相关转录因子展开研究。首先利用肽聚糖刺激巨噬细胞，检测mTOR，S6，4E-BP1蛋白磷酸化水平，观察肽聚糖是否激活mTOR信号通路;其次，分别采用TLR1和TLR2抗体封闭TLR1和TLR2，抑制其作为肽聚糖受体的功能，检测细胞因子表达变化及mTORC1信号通路变化;最后，在转录因子层面上检测转录因子NF-κB和STAT3活性变化情况。结果表明:(1)肽聚糖激活mTORC1信号通路，rapamycin处理后，肽聚糖诱导的mTOR及其下游效应蛋白S6，4E-BP1的磷酸化活性被抑制;(2)采用抗体封闭TLR1和TLR2后，肽聚糖激活的mTORC1信号通路和转录因子STAT3，NF-κB活性降低，表明TLR1和TLR2介导肽聚糖诱导的mTORC1信号通路激活和转录因子活化;(3)抗体封闭TLR1和TLR2后，TNF-α，IL-6和IL-10的分泌均减少，表明TLR1和TLR2介导了肽聚糖诱导的炎性因子TNF-α，IL-6和抑炎因子IL-10的表达。
　　通过第一部分的实验我们可以得到:金黄色葡萄球菌的肽聚糖通过结合受体TLR1和TLR2，激活mTORC1信号通路和转录因子NF-κB和STAT3，进而调控炎症因子TNF-α，IL-6和抑炎因子IL-10的分泌。mTORC1在这一过程中可能通过不同的机制调控炎症因子和抑炎因子的表达。
　　本论文的第二部分以牛乳腺上皮细胞为研究对象，用金黄色葡萄球菌侵染细胞。实验设非处理组，金黄色葡萄球菌侵染组，rapamycin处理组，rapamycin处理后金黄色葡萄球菌侵染组等4组，试图通过比较各组之间的差异表达蛋白筛选出与金黄色葡萄球菌侵染相关并受mTORC1调控的炎性反应相关的细胞因子和信号通路。采用iTRAQ技术获得了4个组的定量蛋白质组数据。通过数据的两两比对获得了4个比较蛋白质组数据及其GO功能分析数据和KEGG pathway功能分析数据。从4组样品中共鉴定出蛋白1761个;筛选出与mTORC1相关的差异表达蛋白54个，对其中可以在KEGG数据库检索到的蛋白22个进行了功能注释;与细菌侵染相关的差异表达蛋白44个，对其中可以在KEGG数据库检索到的蛋白16个进行了功能注释;与细菌侵染并与mTORC1相关的差异表达蛋白61个，对其中可以在KEGG数据库检索到的蛋白27个进行了功能注释;与细菌侵染相关并受到mTORC1调控的差异表达蛋白58个，对其中可以在KEGG数据库检索到的蛋白22个进行了功能注释。
　　综上所述，mTORC1信号通路在调控肽聚糖诱导的炎性反应中发挥重要作用。其可能的分子机制为肽聚糖通过TLR1和TLR2激活mTORC1通路，进而激活转录因子NF-κB和STAT3，调控炎性因子表达。蛋白质组学研究表明，mTORC1可能在金黄色葡萄球菌侵染奶牛乳腺上皮细胞过程中发挥调控作用。项目研究成果丰富了病原体与宿主细胞相互作用研究领域知识，为奶牛乳腺炎的防治提供了基础数据。

目录

声明

摘要

缩写词表

前言

第一章 文献综述

1．1 病原体与宿主的相互作用

1．2 TLRs和mTOR信号通路

1．2．1 TLRs的结构及种类

1．2．2 细胞表面的TLRs及其配体

1．2．3 TLR信号转导通路及调控分子

1．2．4 mTOR及其复合物

1．2．5 mTOR信号通路及功能

1．2．6 TLRs／mTOR信号通路

1．3 金黄色葡萄球菌及其病原相关分子模式

1．3．1 金黄色葡萄球菌的免疫原特异性

1．3．2 肽聚糖及其TLR1／2受体

1．4 小鼠巨噬细胞和奶牛乳腺上皮细胞在免疫应答研究方面的应用

1．5 比较蛋白质组学在病原体与宿主细胞相互作用研究中的应用

第二章 mTORC1在肽聚糖诱导炎性因子表达中的调控作用与机制

2．1 肽聚糖刺激小鼠巨噬细胞Ana-1分泌炎性因子

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．1．3 结果

2．2 肽聚糖诱导Ana-1细胞增殖并激活mTOR信号通路

2．2．1 材料

2．2．2 方法

2．2．3 结果

2．3 TLR1／2介导肽聚糖诱导的mTORC1和转录因子NF-κB，STAT3活化及炎性因子表达

2．3．1 材料

2．3．2 方法

2．3．3 结果

2．4 讨论

第三章 金黄色葡萄球菌(S．aureus)侵染牛乳腺上皮细胞的比较蛋白质组学研究

3．1 材料

3．1．1 实验细胞系

3．1．2 实验用的细菌

3．1．3 主要试剂，耗材与抗体

3．1．4 仪器设备

3．1．5 实验溶液配制

3．2 方法

3．2．1 菌株培养及保存

3．2．2 菌落计数

3．2．3 奶牛乳腺上皮细胞的培养

3．2．4 细胞数计

3．2．5 侵染条件优化

3．2．6 细菌侵染后的菌落计数

3．2．7 蛋白样品制备与质量检测

3．2．8 iTRAQ蛋白质组测定

3．2．9 比较蛋白质组分析和筛选

3．3 结果

3．3．1 最佳MOI及侵染时间的确定

3．3．2 蛋白质组样品的制备与SDS-PAGE分析

3．3．3 蛋白质组的基本信息统计

3．3．4 比较蛋白质组的信息学分析

3．3．5 与金黄色葡萄球菌侵染及与mTORC1相关的蛋白质的筛选

3．4 讨论

结论

参考文献

致谢

攻读博士期间发表的学术论文