LPS诱导人结肠上皮细胞(NCM460)凋亡机制研究

摘要

肠粘膜屏障是肠道内的第一道防线，是可以将肠道细菌与外界隔开的动态结构，能够调节营养吸收以及粘膜免疫平衡。上皮细胞的异常凋亡、紧密连接的结构与功能遭到破坏均可以造成肠粘膜屏障损伤。脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种强促炎分子，肠腔内细菌异常繁殖，LPS产生积累过多，导致粘膜屏障受损，有毒物质释放到血液中，会引起全身性炎症反应。LPS造成粘膜屏障损伤与上皮细胞凋亡和紧密连接蛋白功能异常有关，但具体分子机制尚不明确。
　　本研究选择人正常结肠上皮细胞NCM460为模型，探讨LPS对细胞增殖、凋亡的影响及分子机制，以期为探明LPS致粘膜损伤的机制提供新的佐证。
　　首先我们利用MTT法、Hoechest33342染色、流式细胞术（AnnexinⅤ-PI双染法）、荧光分光光度计法以及Western-blot等方法研究LPS是否诱导人结肠上皮细胞NCM460增殖或凋亡以及对紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达的影响，结果发现:(1) LPS能够显著抑制NCM460细胞增殖且具有浓度依赖性;(2) LPS能够诱导NCM460细胞发生凋亡，有浓度和时间依赖特点，细胞凋亡水平随LPS浓度提高或处理时间延长呈现上升趋势;(3) LPS能够抑制紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，抑制作用随LPS浓度提高明显加强。这些结果表明LPS可以抑制人正常结肠上皮细胞NCM460增殖，诱导其凋亡，并且显著抑制紧密连接蛋白的表达，预示着LPS造成粘膜屏障损伤可能是通过诱导上皮细胞凋亡并抑制紧密连接蛋白的表达而实现的。
　　其次，本研究探讨LPS诱导结肠上皮细胞NCM460发生凋亡的机制。结果发现:(1) LPS刺激NCM460细胞分泌TNF-α，与对照组相比，TNF-α基因转录水平明显升高(p＜0.01)，细胞培养上清中TNF-α的含量也明显升高(p＜0.05);(2) LPS刺激可以导致细胞高表达死亡受体TNFR1、死亡接头蛋白FADD;(3)LPS刺激NCM460细胞后Caspase8的活性明显上升(p＜0.01)，而Caspase9的活性与对照相比却没有显著性变化(p＞0.05);(4) Caspase8抑制剂Z-LETD-FMK显著抑制LPS诱导的NCM460细胞凋亡(p＜0.05)以及TNFR1和FADD的高表达;(4) LPS刺激NCM460细胞后，MyD88的表达水平升高，而TIRAP的表达却不受LPS刺激的影响;(5) LPS处理细胞，膜受体TLR4封闭组与未封闭组相比，TNFR1、MyD88、FADD的表达水平均有明显下降，Caspase3和Caspase8的活性也明显降低(p＜0.05);(6) TNF-α处理NCM460细胞，通过膜受体TNFR1促进FADD的表达。从以上结果我们得出下列结论:(1)LPS通过死亡受体途径诱导NCM460细胞发生凋亡;(2) NCM460细胞通过膜受体TLR4识别LPS，信号转导通路是MyD88依赖型的，构成LPS/TLR4/MyD88信号转导通路;(3) LPS通过MyD88依赖通路诱导NCM460细胞分泌TNF-α。TNF-α通过其受体TNFR1（死亡受体）调节FADD表达，激活死亡受体途径，导致细胞凋亡。
　　最后，本研究探讨了mTORC1信号通路和转录因子STAT1、NF-κB对LPS诱导NCM460细胞凋亡的调控作用。结果发现:(1) LPS刺激NCM460细胞能够激活mTORC1与转录因子STAT1以及NF-κB，且STAT1与NF-κB p65的磷酸化受mTORC1调节;(2) Rapamycin减弱LPS诱导的MyD88、FADD蛋白合成以及FLIP基因转录;(3)Rapamycin抑制LPS诱导的NCM460细胞凋亡、TNF-α的分泌以及Caspase3和Caspase8的活性。从以上结果我们推测mTORC1可能通过激活与凋亡相关的转录因子STAT1以及NF-κB来调节LPS诱导的NCM460细胞凋亡，更具体的分子机制还有待进一步研究。
　　综上所述，LPS可以诱导人正常结肠上皮细胞NCM460凋亡，信号转导通路为MyD88依赖型。细胞通过膜表面受体TLR4识别LPS，继而通过MyD88信号接头蛋白转导信号，构成LPS/TLR4/MyD88信号通路，介导LPS信号调控细胞分泌炎症因子TNF-α; TNF-α可以通过死亡受体TNFR1促进FADD蛋白高表达，从而激活Caspase8/Caspase3相关凋亡通路，引发细胞凋亡;mTORC1信号通路对转录因子NF-κB以及STAT1活性具有调节作用，进而调控凋亡相关基因转录与蛋白表达，实现对LPS诱导NCM460细胞凋亡的调控作用。本研究所得数据为阐明LPS诱导肠上皮细胞凋亡以及肠粘膜损伤的分子机制提供了新的证据。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 肠粘膜屏障

1．2 肠上皮细胞及其凋亡与粘膜屏障的关系

1．3 细胞间紧密连接及其与肠粘膜屏障的关系

1．4 上皮细胞凋亡

1．5 脂多糖在上皮细胞中的凋亡信号通路

1．6 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路与上皮粘膜屏障的关系

1．7 本研究的目的和意义

第二章 LPS对人结肠粘膜上皮细胞NCM460增殖、凋亡及紧密连接蛋白表达的影响

2．1 引言

2．2 实验材料

2．3 实验方法

2．4 结果

2．5 讨论

第三章 LPS诱导NCM460细胞凋亡的分子机制

3．1 引言

3．2 材料

3．3 方法

3．4 结果

第四章 mTORC1信号通路对LPS诱导NCM460细胞凋亡的调控作用

4．1 引言

4．2 材料

4．3 方法

4．4 结果

4．5 讨论

结论

参考文献

附录

致谢

攻读博士期间发表的学术论文