改造和优化人干扰素α-2b基因序列并在大肠杆菌中做表达验证

摘要

提高外源基因的表达水平一直是生物技术探讨的热点问题。在理论上，探讨更有效的基因序列改造和优化方案，对于提高外源基因的表达水平具有重要意义和实用价值。本研究提出了针对人干扰素α-2b基因的改造和优化方案，期望在大肠杆菌中获得高效表达。研究两个部分，第一部分在理论上将人干扰素α-2b基因（IFNα-2b）编码序列（CDS）改造成大肠杆菌高表达基因的偏好模式，然后配置选定的启动子区和终止子区序列以便构成完整基因。第二部分是为了检验我们的理论方法的可靠性，将改造和优化的人IFNα-2b基因在大肠杆菌中表达。 （一）人干扰素α-2b基因改造和优化方案。对编码序列改造分为两步，首先将编码序列中的密码子置换成大肠杆菌高表达基因的最适同义密码子。其次将编码序列中紧邻密码子第三位点的碱基关联置换成大肠杆菌高表达基因的强关联模式。在此过程中，在强关联模式和最适或次最适同义密码子的置换上做出最佳选择。以大肠杆菌中高表达基因lpp的启动区和终止区序列作为改造基因的启动区和终止区序列。以lpp启动区中的SD序列作为高表达启动区的SD序列，将低表达基因的SD序列替换lpp启动区中的SD序列作为对照序列。构造三条完整的人干扰素α-2b基因，它们是“高表达SD+改造前CDS”基因（GWGB），“高表达SD+改造后CDS”基因（GGB）和“低表达SD+改造后CDS”基因（DGB）。 （二）GWGB基因和GGB基因作为第一对照组，检验编码序列改造前和改造后的表达差异。GGB基因和DGB基因作为第二对照组，检验的是高表达SD序列和低表达SD序列对基因表达水平的影响。在大肠杆菌中做表达对比实验，我们采用了两种方式完成表达实验，（1）由于我们设计的序列是一条完整的基因序列，将重组克隆载体pGM-T-IFNα-2b转化至大肠杆菌中进行表达。（2）将重组表达载体pET-28a(+)-IFNα-2b转化至大肠杆菌进行表达（表达载体中的T7启动子被抑制）。（3）最后通过ELISA检测两个载体中人干扰素α-2b基因的表达量。 结果显示：在克隆载体中，编码序列改造后的基因（GGB基因）的表达量显著高于编码序列改造前的基因（GWGB基因）的表达量，表达量提高了55.1%；高表达SD基因的表达量显著高于低表达SD基因的表达量，表达量提高了52.8%。在表达载体中，编码序列改造后的基因的表达量显著高于编码序列改造前的基因的表达量，表达量提高了9.1%；高表达SD基因的表达量显著高于低表达SD基因的表达量，表达量提高了18.2%。结果表明，基因改造和优化的理论方案得到了实验验证。我们的理论方案对于提高外源基因的表达效率具有重要的参考价值。

目录

声明

第一章 前言

1.1干扰素简介

1.2基因工程菌-大肠杆菌

1.3影响外源基因表达的因素

1.4 SD序列对基因表达的影响

1.5研究的目的与意义

第二章 人干扰素α-2b基因的改造和优化

2.1大肠杆菌编码序列与基因表达的关系

2.2基因序列设计

2.3完整基因序列的构建

第三章 材料与方法

3.1 常用仪器与设备

3.2质粒与菌株

3.3 其它试剂及工具酶

3.4 引物设计

3.5 常用溶液

3.6 实验方法

第四章 基因克隆

4.1目的序列与克隆载体的连接

4.2连接产物的转化

4.3人干扰素α-2b在克隆载体中的表达及检测

4.4 ELISA法测人干扰素α-2b表达量

4.5 表达量的显著性检验

第五章 基因表达

5.1表达载体的构建

5.2人干扰素α-2b在表达载体中的表达及鉴定

5.3表达检测

第六章 总结与展望

6.1总结

6.2展望

参考文献

附录

致谢