我国MSM人群HIV-1急性感染者中主要流行的CRF01-AE亚型毒株感染性分子克隆的构建及其生物学特性研究

摘要

目的:
　　男男性接触者(men who have sex with men，MSM)指与其他男性进行性行为的男性，包括同性恋，双性恋，异性恋和易性者。1981年，艾滋病首先在美国一组男同性恋者中被确认。MSM成为世界上第一个被确认的艾滋病高危人群。全球HIV监测数据表明，近年来MSM人群的HIV-1感染率有上升趋势。我国最新的艾滋病疫情报告也显示，新发男男性接触感染者连续几年呈明显上升趋势，2011年4.8万HIV-1新发感染中，同性传播占29.4％，MSM已成为新发感染数最大的高危人群。因此，目前最迫切的工作是加深对MSM人群HIV-1感染情况的了解，明确MSM人群中主要流行毒株及其流行规律，为有针对性的制定预防控制措施提供理论基础。
　　多位学者的研究表明，56％-92％的新感染是由处在急性期的感染者传播的;还有研究显示，这些引起感染的毒株可能是被选择出来传播给新宿主的。对经异性传播HIV-1感染者的研究发现经生殖道粘膜屏障传播的毒株存在明显的传播瓶颈效应，大多数建立有效的感染HIV-1传播是由单一的Transmitted/Founderviruses（T/F毒株）引起的。因此，如果在病毒尚未广泛扩散及整合形成病毒潜伏库时进行有针对性的治疗，建立感染的病毒和病毒感染的细胞是有可能被清除的。然而由于难以获得感染早期病毒复制的粘膜部位标本，目前对于这些引起HIV-1传播和感染的T/F毒株的生物学特性和进化的分子机制仍不清楚。而且，男性和女性在泌尿生殖道和直肠的解剖学和免疫组织学上存在较大差异，使得上述对异性传播感染者实验得到的结果并不完全适用于解释MSM中传播的T/F毒株的特征及在HIV-1传播和建立持续感染中的作用。此外，由于HIV-1具有众多亚型，病毒基因组序列高度多样化;而且通过不同途径传播的T/F毒株在基因型和表现型方面存在明显的差异。因此，为了寻找更好地控制HIV-1在MSM人群中的传播蔓延并改善临床预后的方法，就需要进一步深入开展MSM人群HIV-1主要流行的T/F毒株的生物学特征及致病机理等基础研究。
　　由于HIV感染缺乏理想的动物模型，HIV的体外感染性分子模型即感染性分子克隆成为不可或缺的一种重要研究工具，也为开展该病毒的分子致病机理、基因组结构与功能等基础应用研究提供了前提条件。但目前世界上现有的感染性分子克隆大都是利用欧美和非洲国家的B和C亚型毒株构建而成，并不适用针对中国HIV-1主要流行毒株的研究。
　　目前，我国对MSM人群中HIV-1感染者的研究主要为HIV-1感染率及社会学和行为学的调查，仅有数篇小样本MSM人群HIV-1感染者的病毒亚型分析的报道，而关于该人群HIV-1感染主要流行株的遗传学和病毒学特性的信息较少。我国至今仅有来源于既往有偿献血员中流行的B哑型以及IDUs感染者中流行的CRF07_BC和CRF08_BC亚型的感染性分子克隆，尚未见目前新发感染数最大的高危人群MSM中主要流行毒株感染性分子克隆的相关报道，更无其早期传播毒株感染性分子克隆的报道。
　　综上所述，本研究在全国第二大MSM聚集地的辽宁省，对MSM中的HIV-1感染者进行分子流行病学调查，明确在我国MSM中主要流行的病毒亚型，并选取其中有代表性的早期传播毒株分离其原代病毒株，并进行感染性分子克隆的构建，借助此感染性分子克隆对MSM中主要流行毒株进行生物学特性研究，为探讨MSM中HIV-1快速传播的机制以及研发有效的抗病毒药物和疫苗等方面的研究提供良好的技术平台。
　　方法:
　　一、研究对象
　　229名经男男性接触感染HIV-1的成年（18岁以上）男性。征得患者的知情同意后进行面对面问卷调查采集相关流行病学信息，所有病例均否认静脉吸毒史和卖/输血史，在采集血样时均未接受任何抗艾滋病毒治疗;采集EDTA抗凝外周静脉血，6小时内常规离心，分离血浆，分装后-80℃低温保存。
　　二、实验方法
　　（一）病毒核酸提取
　　以140μl血浆按照QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书步骤提取病毒基因组 RNA。以1×106个细胞按照QIAamp DNA Blood Mini Kit说明书步骤提取前病毒基因组DNA。
　　（二）PCR扩增、产物纯化及基因序列测定
　　使用反转录PCR和套式PCR方法，分别扩增pol基因(nt2252-3299，蛋白酶1-99密码子和反转录酶1-250密码子)和env基因(nt7011-7715，C2-V5)。PCR产物纯化参照QIAquick Gel Extraction Kit操作步骤。利用测序引物进行测序反应，纯化后上机检测。
　　（三）序列分析
　　采用BioEdit软件对测序结果进行编辑处理，然后进行拼接。用Mega5.0软件自展法(bootstrap)重复运算1000次构建Neighbor-Joining(NJ)进化树。利用Mega软件中的distance程序中的Kimura双参数方法计算序列间的基因离散率。用HIVDatabase中VESPA软件分析两个流行簇毒株遗传变异特征;Highlighter软件对序列进行比较，并标记出匹配/不匹配、有义/无义突变及超突变等特征。用Geno2pheno软件预测对病毒的辅助受体使用情况。
　　（四）病毒载量测定
　　以1ml血浆采用标准版模板制备法提取RNA，使用COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-12.0(ROCHE)以TaqMan RT-PCR方法测定病毒载量。
　　（五） HIV-1抗体检测
　　1、ELISA法
　　使用法国生物梅里埃公司第三代检测试剂盒，参照试剂盒说明书进行检测。
　　2、WB法
　　使用新加坡MP生物医学亚太私人有限公司人类免疫缺陷病毒(HIV1+2型)抗体检测试剂盒，参照试剂盒说明书进行检测。
　　（六）SGA法扩增近全长序列及基因序列测定
　　使用反转录PCR和套式PCR方法，分别扩增5'amplicon(nt634-5066)和3'amplicon(nt4900-9612)。经琼脂糖凝胶电泳确定有目的条带的PCR产物送至华大基因科技有限公司（北京）进行walking sequencing。
　　（七）扩增全长序列及基因序列测定
　　使用套式PCR方法，分别扩增5'half genome(nt1-5066)和3'half genome(nt4900-9719)。经琼脂糖凝胶电泳确定有目的条带的PCR产物送至华大基因科技有限公司（北京）进行walking sequencing。
　　（八）分子克隆
　　1、半分子克隆
　　参照TOPOXL PCR CloningKit说明书，纯化PCR产物后，进行TOPO克隆反应和化学转化，构建半分子克隆。
　　2、质粒提取及基因序列测定
　　参照QIAprep Spin Miniprep Kit说明书提取半分子克隆的质粒DAN;进行酶切、电泳鉴定。经鉴定已插入目的片段的半分子克隆送至华大基因科技有限公司（北京）进行walking sequencing。
　　3、全基因组克隆及基因序列测定
　　分别将5'和3'半分子克隆用NdeⅠ和NotⅠ双酶切并纯化后，分别回收8.5kb和5kb片段;在T4DNA连接酶作用下，于4℃连接过夜;经酶切和电泳鉴定已插入目的片段的全基因组克隆送至华大基因科技有限公司（北京）进行walkingsequencing。
　　（九）质粒DNA的转染
　　参照Fugene6 Transfection Reagent说明书将全基因组克隆转入293T细胞;37℃，5％CO2条件下培养48小时，取200μl上清进行HIV-1 p24抗原检测，2ml冻存于-156℃。
　　（十）WB法检测转染后的293T细胞中的蛋白表达情况
　　参照《分子克隆》提取转染后293T细胞的蛋白，进行SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，分别与一抗和二抗封闭作用后，参照ECL显色试剂盒说明书进行检测。
　　（十一）HIV-1病毒分离
　　利用密度梯度离心法分离正常人和HIV-1感染者的PBMC;采用PBMC共培养法复制病毒。每3-4天换液1次，每7天添加1次经PHA刺激生长3天的正常淋巴细胞。定期对培养细胞上清中的HIV-1p24抗原含量进行检测。
　　（十一）HIV-1病毒生物学特性研究
　　利用TZM-b1细胞检测病毒感染性，利用PBMC检测病毒复制能力，利用GHOST-CD4-CXCR4/CCR5细胞检测病毒辅助受体利用情况。
　　（十二）HIV-1 p24抗原检测
　　参照美国Zeptometrix公司HIV-1 p24抗原定量检测试剂盒说明书进行检测。
　　（十三）统计学处理
　　本研究涉及统计分析和相关性分析均采用spss18.0软件包处理。
　　结果:
　　一、MSM人群中流行的HIV-1主要基因型及其特征研究
　　（一）辽宁省MSM人群HIV-1感染者基因亚型分布及与全国流行毒株的关系
　　利用NJ系统进化树综合分析pol和env基因序列，发现我省MSM人群HIV-1感染者中存在CRF01_ AE、B/B'、CRF07_BC3种亚型。其中CRF01_AE亚型占85.6％(196/229)，B/B'亚型占9.6％(22/229)，CRF07_BC占3.5％(8/220)。其中CRF01_AE亚型毒株主要分为两簇，cluster1毒株与我国其他地区MSM中流行毒株聚集成簇，推测其与我国MSM中广泛流行毒株具有更近的遗传亲缘关系;cluster2毒株虽人数众多，但组内基因距离较小，同源性较高，且与我省经异性传播毒株距离较近，提示可能经异性接触传入，由奠基者效应引起在辽宁省内MSM人群的扩散传播。
　　（二）辽宁省MSM人群HIV-1感染者基因亚型分布的历年演变情况
　　2000-2010每年新确诊病例中CRF01_ AE亚型均占72.0％以上，为辽宁省MSM人群主要的HIV-1流行毒株。其中cluster1上升趋势显著，而cluster2自2008年开始下降。相同的趋势也出现在2009年和2010年新发现的急性HIV-1感染者中。因此，推测虽然cluster2毒株在辽宁省MSM中感染者存在一定的奠基者效应，而cluster1毒株近年来增加较快，值得关注。
　　（三）辽宁省MSM人群HIV-1感染者中流行的CRF01 AE毒株V3区氨基酸特征
　　V3区顶端四肽是最重要的中和抗体决定簇，cluster1毒株主要表现为GPGQ而cluster2毒株主要为GPGR，两者存在显著性差异。经比较cluster1和cluster2毒株在辅助受体利用情况上无差异，均以CCR5作为辅助受体为主。cluster1和cluster2毒株在V3区的氨基酸序列主要存在4个特征性氨基酸位点，分别位于第13、18、19和32位。其中第18位氨基酸位于顶端四肽，第13、18和19位氨基酸存在电荷差异，主要表现为cluster1为带正电荷，而cluster2为带负电荷。这些氨基酸电荷的差异会引起蛋白空间构象的不同，从而直接影响病毒的生物学性质。与我国其他地区MSM中流行的CRF01_ AE亚型毒株比较后发现，cluster1毒株与其在这几个位点上的特征性氨基酸组成更为类似。因此，推测cluster1和cluster2毒株可能具有不同的生物学特性，而cluster1毒株与国内其他地区MSM中流行的毒株有更相似的生物学特征。
　　二、MSM中HIV-1急性感染者代表性病毒株的选取及其病毒生物学特性研究
　　（一）代表性毒株的选择
　　选取cluster1中的急性感染者为研究对象。结合病毒RNA、抗体WB检测结果及流行病学资料，对基因序列分析后，选择资料完整的患者320008为研究对象进行下一步验证。获得其感染第30天（第一点，FiebigⅣ期，仅有血浆样本）、第47天（第二点，FiebigⅥ期，保留血浆和PBMC样本）和第54天（第三点，FiebigⅥ期，保留血浆和PBMC样本）血浆病毒RNA进行近全长序列扩增。比较后发现在第二、三点与第一点高度相似，但存在3个可遗传的有义突变，分别位于gag基因p17末端(423)，tat基因第一外显子末端(70)，env基因C4起始位置(2)，而且第二点与第三点病毒相比拥有较少的G-＞A超突变和gag区的变异，意味着第三点病毒受宿主免疫压力的影响较大，从而推测第二点病毒应是更接近建立感染的早期传播毒株。
　　利用SGA方法扩增第二点样本的近全长序列，分别比较其5'和3'amplicon的序列后发现，序列间核苷酸变异率较小，组内遗传距离均为0.001±0.000。由此可知，第二点5'和3'SGA amplicon的遗传同质性均较高，因此推断第二点病毒还是单一的毒株，受宿主免疫压力影响较小，仍具有建立感染的早期传播毒株的特征;且与现有CRF01_ AE亚型感染性分子克隆的基因距离较远，推测这些感染性分子克隆与我国MSM人群中流行的CRF01 AE亚型的早期传播毒株在某些生物学特性上可能会存在差异，并不适用于研究我国MSM人群的HIV-1主要流行毒株的生物学特征及致病机理等基础研究。
　　（二）早期传播毒株原代病毒的分离及其病毒生物学特性
　　利用PBMC共培养法，我们成功分离了前期选取的患者320008感染第47天的原代病毒08-ISO，其能感染TZM-b1和PBMC细胞，并可在其中复制，且复制水平较高，以CCR5作为辅助受体，具有巨噬细胞嗜性的特性，是具有早期传播毒株表型特征的原代病毒。综上，我们获得了一株具有高度遗传同质性、有感染和传播能力的代表性毒株，其在基因型和表型上都具备早期传播毒株的特征。
　　三、CRF01-AE亚型HIV-1早期传播毒株感染性分子克隆的构建及其生物学特征的初步研究
　　（一）320008毒株全基因组克隆的构建与鉴定
　　320008原代病毒(08-ISO)体外培养后，提取前病毒基因组DNA，两段法分别扩增5'半分子(5'LTR-vif,1-5066nt)和3'半分子(vif-3'LTR，4900-9719nt)后，分别克隆入TOPO PCR-XL载体构建成半分子克隆，再利用NdeⅠ酶切位点连接为全基因组克隆。其基因序列结果显示，全基因组克隆包括完整的HIV-1结构，且无移码突变和终止密码。经NJ系统树分析表明，其与病毒RNA近全长的共享序列高度同源，且与前期研究中CRF01 AE cluster1中毒株聚集成簇，远离现有的来源于慢性经异性传播CRF01 AE亚型感染者的感染性分子克隆。
　　（二）320008衍生病毒的产生及其HIV-1主要结构蛋白的表达情况
　　全基因组克隆转染293T细胞48小时后，收集上清检测其HIV-1 p24抗原，均在1×105 pg/ml以上，说明有衍生病毒产生。利用Western Blotting技术检测转染后的293T细胞，其结果显示有gp160，gp120，gp41，p64，p53，p24和p17等蛋白表达，提示我们构建的全基因组克隆可以在细胞内转录并翻译出HIV-1的结构和功能蛋白，并被细胞蛋白酶很好地切割，具备了组装HIV-1_病毒颗粒的条件，是具有感染性的全基因组克隆即感染性分子克隆(08-IMC)。
　　（三）感染性分子克隆生物学特性的研究
　　感染性分子克隆(08-IMC)转染293T细胞后，收获的衍生病毒能感染TZM-b1和PBMC细胞，并可在其中复制，但衍生病毒的复制水平显著低于其原代病毒(08-ISO);与原代病毒(08-ISO)的情况一致，衍生病毒也以R5作为辅助受体，具有巨噬细胞嗜性的特性，。因此，我们获得的感染性分子克隆(08-IMC)也具有早期传播毒株的特征。
　　结论:
　　1.CRF01 AE是辽宁省MSM人群中主要流行的HIV-1亚型，主要分为两大簇，其中近年来增加较快的cluster1与cluster2在V3区氨基酸特征上存在显著差异，而与我国其他地区MSM中流行的毒株相似，基因距离较近，具有较近的亲缘关系。
　　2.筛选cluster1毒株，选取一例感染47天处于FiebigⅥ期的感染者320008分离其原代病毒08-ISO并检测其病毒生物学特性，结果显示其病毒RNA具有较高的遗传同质性，是早期感染的单一毒株;原代病毒08-ISO可以利用CCR5辅助受体感染TZM-b1细胞和PBMC，并可在其中复制，且复制水平较高。由此可以确定原代病毒08-ISO是目前在我国MSM人群中主要流行的CRF01_AE亚型毒株中具有代表性的有感染和传播能力的早期传播毒株。
　　3.利用08-ISO构建的感染性分子克隆08-IMC与目前我国MSM人群中主要流行的CRF01 AE毒株遗传距离接近，同源性较高，有较近的亲缘关系;其衍生病毒与原代病毒生物学性质相似，因此可以认为感染性分子克隆08-IMC是目前我国MSM中主要流行的CRF01 AE早期传播毒株的感染性分子克隆。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 MSM人群中HIV-1主要流行毒株基因型及其特征研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 MSM中HIV-1急性感染者代表性病毒株的选取及其病毒生物学特性研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文三 CRF01-AE亚型HIV-1早期传播毒株感染性分子克隆的构建及其生物学特征的初步研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 HIV-1 CRF01-AE毒株全长基因组及其感染性分子克隆的研究进展

致谢

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