氟西汀长期给药后活体动物脑内特异性基因的表达和编辑及在慢性应激快感缺失后基因表达的改变

摘要

目的：
　　氟西汀作为一种五羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)，一方面能够抑制五羟色胺的再吸收，提高突触间隙中五羟色胺的浓度，另一方面可以结合并激活5-HT2B受体，引起细胞内部钙离子浓度增加，激活锌依赖性的金属蛋白酶(MMPs)，导致某些生长因子释放，比如表皮生长因子HB-EGF的释放。近年来人们比较关注于氟西汀对行为学相关基因的影响，这些与行为学相关的基因包括:5-HT2受体，其中包括5-HT2B(Htr2b)和5-HT2C(Htr2c);编码cPLA磷脂酶基因cpla2，其中包括cPLA2a(Pla2g4a);还有编码GluK2的海藻氨酸盐受体基因Grik2和编码GluK4的海藻氨酸盐受体基因Grik4。
　　RNA腺苷酸脱氨酶（adenosine deaminases acting in RNA，ADARs）是一种酶家族，可将某些mRNA腺嘌呤核苷去氨基酸转化为次黄嘌呤核苷，即A-to-I转换。ADARs可编辑5-HT2受体和GluK2的mRNA表达。
　　荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)的方法可根据细胞特异性标记物分选出新鲜分离转基因鼠的星形胶质细胞或神经元细胞，通过这一方法可以进一步验证我们之前在原代细胞培养和整体动物中的结果，另一方面也可以克服原代培养神经元细胞不能进行氟西汀慢性处理的缺点。
　　动物模型的建立对于了解应激诱导的行为学改变的病理生理及形成有效的治疗方案来说极其重要。理想的慢性应激动物模型能够复制出应激应答的各个方面并能够模拟疾病的发生。我们研究组建立了小鼠的抑郁模型，快感缺失是抑郁的主要特征，通过糖水摄取试验检测快感缺失。可以研究氟西汀对快感缺失小鼠脑内细胞上述基因mRNA表达，这使得人们研究氟西汀对抑郁症又进了一步。
　　方法：
　　建立转基因小鼠的抑郁模型，应用real-time PCR检测小鼠在慢性应激刺激快感缺失情况下的5-HT2B受体，5-HT2C受体，cPLA2a，ADAR2，GluK2及GluK4基因的表达。氟西汀（10 mg/kg）腹腔注射转基因小鼠，观察氟西汀和（或）慢性应激快感缺失对星形胶质细胞或神经元细胞5-HT2B受体，5-HT2C受体，cPLA2，ADAR2，GluK2及GluK4基因表达的影响。并且，经PCR测序研究氟西汀对5-HT2B受体与GluK2 RNA编辑的影响。使用SPSS13.0软件进行统计学分析，多组资料用one-way ANOVA方法进行比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1、Cfos和fosB mRNA表达
　　氟西汀10 mg/Kg腹腔注射2小时后取脑，观察氟西汀对极早基因cfos和fosB表达的影响。在星形胶质细胞和神经元细胞中，cfos和fosB mRNA表达上调。
　　2、五羟色胺转载体mRNA表达
　　五羟色胺转载体在整体动物的星形胶质细胞中没有表达，这与之前我们在原代星形胶质细胞中得出的结果一致。
　　3、慢性应激诱导快感缺失转基因小鼠基因表达
　　(1)5-HT2B受体mRNA水平
　　在正常组转基因小鼠中星形胶质细胞和神经元中均有5-HT2B受体表达。经氟西汀慢性处理（2周）后，正常组转基因动物组星形胶质细胞中5-HT2B受体表达水平显著上调(P＜0.01)。而在慢性应激刺激快感缺失组转基因小鼠中，星形胶质细胞5-HT2B受体表达水平是显著下降的(P＜0.01)，经氟西汀慢性处理(2周)的快感缺失组转基因小鼠5-HT2B受体表达水平显著上升(P＜0.05)，并与未经氟西汀处理的正常组转基因小鼠星形胶质细胞5-HT2B受体表达水平无显著差异。神经元细胞5-HT2B受体表达水平未受到氟西汀长期给药及慢性应激处理后快感缺失的影响。
　　(2)5-HT2C受体mRNA水平
　　在正常转基因小鼠中星形胶质细胞和神经元中均有5-HT2C受体表达。经氟西汀慢性处理（2周）后，正常组转基因动物神经元细胞5-HT2C受体表达水平显著上调(P＜0.01)。经慢性应激刺激快感缺失组转基因小鼠神经元细胞较正常组转基因小鼠神经元细胞5-HT2C受体表达水平相比无显著性改变，而经氟西汀慢性处理后快感缺失组转基因小鼠神经元细胞5-HT2C受体表达水平显著上升(P＜0.01)，并与经氟西汀处理的正常组转基因小鼠神经元细胞5-HT2C受体表达水平无显著差异。即5-HT2C受体表达未受慢性应激处理后快感缺失的影响。星形胶质细胞5-HT2C受体表达未受到氟西汀长期给药及慢性应激处理后快感缺失的影响。
　　(3) cPLA2a mRNA表达水平
　　在正常转基因小鼠中星形胶质细胞和神经元中均有cPLA2a受体表达。经氟西汀慢性处理（2周）后，在正常组转基因动物星形胶质细胞中cPLA2a表达水平显著上调(P＜0.01)。慢性应激刺激后快感缺失组转基因小鼠星形胶质细胞cPLA2a表达水平较正常组转基因鼠表达显著下降(P＜0.01)，而在经氟西汀慢性处理后快感缺失组转基因小鼠星形胶质细胞cPLA2a表达水平显著上升(P＜0.05)，并与正常组转基因小鼠星形胶质细胞cPLA2a表达水平无显著差异。转基因小鼠神经元细胞cPLA2a表达水平均未受氟西汀长期给药及慢性应激处理后快感缺失的影响。
　　(4) ADAR2 mRNA表达水平
　　在正常转基因小鼠中星形胶质细胞和神经元中均有ADAR2表达。经氟西汀慢性处理（2周）后，正常组转基因动物星形胶质细胞中ADAR2表达水平显著上调(P＜0.01)。经慢性应激刺激后快感缺失组转基因小鼠无论是否进行氟西汀慢性处理星形胶质细胞ADAR2表达水平均较正常组转基因小鼠ADAR2表达下降(P＜0.01)。神经元细胞ADAR2表达水平未受到氟西汀长期给药及慢性应激处理后快感缺失的影响。
　　(5) Gluk2 mRNA表达水平
　　在正常转基因小鼠中星形胶质细胞和神经元中均有Gluk2表达。经氟西汀慢性处理（2周）后，在正常组转基因动物星形胶质细胞Gluk2表达水平显著上调(P＜0.01)。而经慢性应激刺激后快感缺失组转基因小鼠无论是否经过氟西汀处理星形胶质细胞Gluk2表达水平均较正常组转基因小鼠相比无明显变化。转基因小鼠神经元细胞Gluk2表达水平未受到氟西汀长期给药及慢性应激处理后快感缺失的影响。
　　(6) Gluk4 mRNA表达水平
　　在正常转基因小鼠中星形胶质细胞和神经元中均有Gluk4表达。经氟西汀慢性处理（2周）后，正常组转基因鼠神经元细胞中Gluk4表达水平显著上调(P＜0.01)。经慢性应激刺激后快感缺失组转基因小鼠，神经元细胞Gluk4表达水平显著下降(P＜0.01)，而经氟西汀慢性处理后快感缺失组转基因小鼠Gluk4表达水平显著上升(P＜0.05)，并与正常组转基因小鼠神经元细胞Gluk4表达水平无显著差异。星形胶质细胞Gluk4表达水平未受到氟西汀长期给药及慢性应激处理快感缺失的影响。
　　5、Gluk2 RNA编辑
　　转基因小鼠经流式细胞分选后分离出星形胶质细胞或神经元细胞，其PCR产物完成GluK2的基因测序。GluK2的3个编辑位点（I/V, Y/C和Q/R）可通过测序得到的校正曲线来计算其编辑水平。结果如图所示。编辑的(V，C，R)和未编辑的(I，Y，Q)的GluK2 PCR产物（上海生工）按100∶0（100％编辑），90∶10，80∶20，70∶30，60∶40比例得出GluK2 RNA编辑的校正曲线，正常对照组和氟西汀腹腔注射组可通过该校正曲线得到星形胶质细胞或神经元细胞相应的GluK2 G/G+A比率。结果得出，在正常对照组，星形胶质细胞或神经元细胞I/V位点编辑比率大约为84％，Y/C位点编辑比率为82％，Q/R位点的编辑比率为82％。在氟西汀处理2周的整体动物中，在神经元细胞3个位点的编辑比率没有发生变化，而在星形胶质细胞中I/V位点编辑比率大约为92％，Y/C位点编辑比率为89％，Q/R位点的编辑比率为90％。这提示氟西汀诱导了星形胶质细胞GluK2的mRNA编辑。
　　6、5-HT2B受体RNA编辑
　　在神经元细胞中，无论氟西汀处理与否，测序结果提示5-HT2B受体的8个编辑位点均未编辑，而在星形胶质细胞中，对照组未经处理的转基因动物大脑分离出来的星形胶质细胞5-HT2B受体8个编辑位点均上升了25％，而每个编辑位点间没有区别。
　　结论：
　　有关SSRIs作用的研究长期以来一直关注于SERT。本文联合之前在星形胶质细胞系中我们研究氟西汀与5-HT2B受体之间有相当高的亲和力，所有5种传统SSRIs有相似性，这些均为星形胶质细胞是SSRIs作用的第二靶点也许是比SERT更为重要的靶点提供了丰富的证据。

目录

声明

论文一 氟西汀长期给药后活体动物脑内特异性基因的表达和编辑及在慢性应激快感缺失后基因表达的改变

摘要

英文缩略语

前言

研究目的

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

论文二 星形胶质细胞中氟西汀对小窝蛋白表达的作用机制

摘要

英文缩略语

前言

研究目的

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 小窝蛋白的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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