白藜芦醇对衰老模型小鼠血浆同型半胱氨酸水平及氧化应激水平影响的实验研究

摘要

前言
　　白藜芦醇(Resveratrol，RSV)是植物在恶劣环境下或遭到病原体侵害时，自身分泌的一种可抵御霉菌感染的多酚类抗毒素。具有抗血小板聚集、诱导肿瘤细胞凋亡、提高免疫功能、抗炎、抗氧化、降血脂、抗衰老等多种生理活性。
　　同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是蛋氨酸(Methionine，Met)循环的正常代谢产物，是能量代谢的重要中间产物。Hcy的水平升高，会产生一系列不良反应，其中以诱发心脑血管病变最受关注。此外，对肝细胞的损伤和变性也有影响。
　　自由基在机体内有很强的氧化反应能力，且易产生连锁反应，从而导致机体的衰老。研究表明，RSV可通过抗氧化途径来延缓机体的衰老。氧化应激既是加速机体衰老的重要原因，也是许多疾病如高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia，HHcy)、肝脏和血管损伤的病理基础。目前的研究认为，HHcy是心脑血管疾病的独立危险因素。HHcy诱导的氧化应激反应产生的氧自由基可能参与动脉粥样硬化过程。而RSV的抗氧化作用可能能改善Hcy的氧化应激毒性。
　　目前，对RSV的相关生物学功能的研究中，多采用45mg/kg.bw.d，而本课题前期研究，22.5mg/kg.bw.d也具有明显的生物学效应。为此本研究采用两个剂量RSV对拟衰老模型小鼠进行预防性干预，以观察RSV对小鼠血浆Hcy水平和机体氧化应激状态的影响以及是否存在剂量反应关系，旨在探讨RSV能否通过降低血浆Hcy的水平来发挥其抗衰老作用，以期为进一步研究RSV延缓衰老提供一定依据。
　　材料和方法
　　一、动物的分组与喂养
　　16w龄SPF级雄性昆明种小鼠72只，体重35-40g，由中国医科大学实验动物中心提供。适应性喂养1w后，按体重随机分为基础组、衰老组、干预Ⅰ组和干预Ⅱ组，每组18只。基础组每日颈背部皮下注射生理盐水，其余三组注射200mg/L的D-半乳糖(D-galactose，D-gal)溶液。基础组和衰老组每日给予0.5％的羧甲基纤维素钠溶液灌胃，干预Ⅰ组和干预Ⅱ组分别给予22.5mg/kg.bw.d和45mg/kg.bw.d的RSV溶液灌胃。小鼠饲养过程中，采取每笼5-6只，温度22±2℃，湿度40-70％，自然光照，自由摄食饮水，每周称量体重2次，饲养16w。饲料由中国医科大学实验动物中心提供。
　　二、测定指标及方法
　　于第16w末，每组随机抽取12只小鼠，测定血浆Hcy、肝脏和血清氧化应激指标，每组余下的6只小鼠，灌流固定观察动脉病理学改变。
　　（一）Hcy的测定（高效液相色谱法）
　　样品处理:摘眼球取血置于2mlEP管中，离心15min，3000r/min，取上清备用。
　　取100μl血清和200μl乙腈于1.5mlEP管中，涡旋30s，离心10min，13000rpm，吸取上清250μl，氮气吹干(40℃)，加入缓冲液200μl和丹黄酰氯200μl，涡旋30s（避光），65℃避光衍生25min，过滤，进样10μ1。
　　（二）氧化应激指标
　　将小鼠乙醚麻醉，摘眼球取血，离心分离小鼠血清;解剖取200mg肝组织，匀浆;分别测定下列指标:
　　谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase，GSH-PX):二硫代二硝基苯甲酸法
　　超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD):黄嘌呤氧化酶法
　　丙二醛(Maleicdialdehyde，MDA):硫代巴比妥酸法
　　总抗氧化能力(Totalantioxidantcapacity，T-AOC):按照试剂盒说明测定;
　　（三）病理切片
　　采用4％多聚甲醛固定液灌流后，分离取下小鼠颈动脉和肝脏，浸泡24h，石蜡包埋、切片，HE染色，在显微镜下观察动脉和肝脏的病理改变。
　　三、数据处理和统计分析
　　用SPSS13.0统计软件进行数据分析，实验结果用(X)±S表示，用方差分析比较不同干预组各指标间的统计学差异。检验水准:α=0.05。
　　结果
　　一、小鼠一般状态观察
　　基础组小鼠活泼好动、毛发光亮而浓密、皮肤弹性好;衰老组小鼠表现出少动、行动迟缓、毛色发黄、稀疏并渐有脱毛现象，皮肤松弛、弹性下降;干预组小鼠总体状态好于衰老组。
　　二、血浆同型半胱氨酸水平
　　与基础组比较，衰老组小鼠血浆Hcy水平升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与衰老组比较，干预组小鼠血浆Hcy水平下降(P＜0.05)。两个干预组之间没有统计学差异（P＞0.05）。
　　三、氧化应激指标
　　与基础组比较，衰老组小鼠血清和肝脏SOD、T-AOC和GSH-Px活性均降低，MDA含量升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。与衰老组比较，干预组小鼠血清和肝脏SOD、T-AOC和GSH-Px活性均升高，MDA含量下降，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。两个干预组之间没有统计学差异（P＞0.05）。
　　四、病理切片
　　1、动脉病理切片
　　基础组动脉内膜完整，细胞排列整齐，结构清晰;衰老组动脉内膜略增厚，动脉壁层次欠清晰，形态不规则，向管腔内突起，平滑肌细胞增殖，平滑肌细胞和弹性纤维排列紊乱，炎性细胞浸润。两个干预组与基础组相似，动脉内膜基本完整。
　　2、肝脏病理切片
　　基础组小鼠肝细胞形态正常，胞核清晰，胞浆丰富，间质无水肿;衰老组小鼠肝细胞发生变性，体积变小，胞核与胞浆界限模糊，核固缩成三角形或不规则形;与衰老组相比，干预组小鼠仍有不同程度的肝细胞变性，但变性细胞数量显著减少;干预Ⅱ组与干预Ⅰ组小鼠肝细胞染色结果基本相同。
　　结论
　　1、RSV干预组小鼠血浆Hcy水平低于衰老组，接近基础组;
　　2、RSV干预组小鼠血清和肝脏SOD、T-AOC、GSH-PX均高于衰老组，MDA低于衰老组;接近基础组;
　　3、RSV干预组小鼠动脉和肝脏损伤较衰老组轻微，接近基础组;
　　4、干预Ⅰ组(22.5mg/kg.bw.d)与干预Ⅱ组(45mg/kg.bw.d)比较，各指标均未出现统计学意义，22.5mg/kg.bw.d更适用于实际应用中。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

三、数据处理和统计分析

结果

一、小鼠一般状态观察

二、血浆同型半胱氨酸水平测定结果

三、氧化应激指标

四、病理切片

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 同型半胱氨酸的研究进展

致谢

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