日本七鳃鳗非受体酪氨酸激酶BTK的全长cDNA克隆和生物信息学分析

摘要

酪氨酸激酶BTK是非受体酪氨酸家族的成员,它由PH结构域、TH结构域、SH3结构域、SH2结构域和催化结构域五部分组成。BTK参与多种信号通路,在免疫系统中发挥重要作用。近年来BTK参与B细胞信号通路、TLR信号通路和肥大细胞脱颗粒等信号通路的具体机制问题是科学研究的热点。BTK对细胞的增殖、分化和凋亡起着重要的调控作用,其突变可导致X连锁无丙种球蛋白血症,临床表现为反复的细菌感染和B细胞数量的显著下降。本文收集了日本七鳃鳗的白细胞并提取总RNA,利用紫外光分光光度计和琼脂糖凝胶电泳的方法检测提取的总RNA质量。通过RACE的实验方法从日本七鳃鳗白细胞中成功扩增BTK基因并克隆后到pET32a(+)载体。从一级结构比对、高级结构预测、保守基序的分布、构建进化树等方面分析了这段序列。
　　 主要的研究结果如下:
　　 1、一级结构比对结果表明日本七鳃鳗白细胞的BTK基因的氨基酸序列与黑猩猩、人类、马、牛、小家鼠、犬属、鸭嘴兽、原鸡、斑马鱼、盲鳗和果蝇等其他物种的BTK基因的氨基酸序列同源性很高。
　　 2、利用软件MEME预测日本七鳃鳗BTK氨基酸序列的高级结构,包括预测PH结构域的高级结构、SH3结构域的高级结构和激酶结构域的高级结构。预测结果表明日本七鳃鳗BTK的高级结构与模板BTK的高级结构十分相似。
　　 3、利用MEME在线软件分析在不同物种的BTK氨基酸序列中发现的保守基序的类型和分布,结果表明日本七鳃鳗BTK的氨基酸序列拥有全部的10个保守基序。
　　 4、基于邻接法构建的氨基酸序列进化树表明,所有的BTK氨基酸序列被分为两簇,一簇包括哺乳动物、鸟类、鱼类和七鳃鳗,另一簇包括盲鳗和昆虫类。
　　 综合上述的研究结果得出:在最原始的脊椎动物七鳃鳗中存在非受体酪氨酸激酶BTK,它的具体的免疫机制尚不明确。

目录

文摘

英文文摘

引言

1 酪氨酸激酶BTK的研究进展

1.1 BTK的染色体定位、基因结构和分布

1.2 参与多种信号通路

1.2.1 参与B细胞介导的信号通路

1.2.2 BTK参与Toll样受体介导的信号通路

1.2.3 BTK参与肥大细胞脱颗粒

1.3 其他的BTK参与信号通路

1.4 性联无丙种球蛋白血症(XIA)的临床表现

1.5 小结

2 日本七鳃鳗非受体酪氨酸激酶的BTK基因克隆

2.1 材料和方法

2.1.1 材料

2.1.2 日本七鳃鳗白细胞总RNA的提取

2.1.3 已知序列验证

2.1.4 cDNA3' 末端快速扩增反应(3' RACE)

2.1.5 cDNA5'末端快速扩增反应(5'RACE)

2.1.6 序列拼接、BLAST搜索和最终验证

2.1.7 CDS区克隆

2.2 结果

2.2.1 日本七鳃鳗白细胞的总RNA提取

2.2.2 cDNA3' 末端快速扩增反应(3' RACE)实验结果

2.2.3 cDNA5'末端快速扩增反应(5'RACE)实验结果

2.2.4 克隆结果

2.2.5 PCR扩增目的基因CDS区电泳结果

2.2.6 载体处理后电泳结果(图2-5)

2.3 讨论

2.3.1 基本的局部联配搜索工具BLAST的使用

2.3.2 RACE实验中的遇到的实际问题和解决方法

2.4 结论

3 日本七鳃鳗BTK基因生物信息学分析

3.1 材料和方法

3.1.1 收集其他物种的BTK氨基酸序列

3.1.2 功能结构域预测

3.1.3 一级结构比对

3.1.4 高级结构的预测和分析

3.1.5 保守基序(Motif)分析

3.1.6 氨基酸序列跨膜结构域预测

3.1.7 信号肽结构预测

3.1.8 分子系统发育分析

3.1.9 氨基酸序列理化性质分析

3.2 结果

3.2.1 功能结构域预测结果

3.2.2 一级结构比对

3.2.3 高级结构预测结果

3.2.4 保守基序分析结果

3.2.5 氨基酸序列跨膜结构域预测

3.2.6 氨基酸序列信号肽结构预测

3.2.7 分子系统发育分析

3.2.8 理化性质分析结果

3.3 讨论

3.3.1 BTK基因保守基序的进化

3.3.2 BTK的系统发育关系

3.4 结论

4 全文总结

4.1 结构分析

4.2 保守基序分析

4.3 构建系统发育树

参考文献

附录 A已知序列

附录 B日本七鳃鳗BTK基因mRNA全长

附录 C日本七鳃鳗BTK基因CDS区序列

附录 D日本七鳃鳗BTK基因CDS区翻译后的氨基酸序列

附录 E不同物种的BTK基因的FASTA格式氨基酸序列

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢