下调Notch1基因调控乳腺癌干细胞耐药机制的研究

摘要

肿瘤组织及许多肿瘤细胞系中的肿瘤细胞在存在着异质性，即同一种细胞在性质、分化及功能上有很大的差异，其中一小部分细胞具有干细胞的自我更新和分化的能力，一定程度上扮演了干细胞的角色，这些细胞是肿瘤起始的源泉，在维持肿瘤生长、血管生成及促进肿瘤转移中起决定性作用，被命名为肿瘤干细胞(cancerstemcells，CSC)。到目前为止，已在乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌和头颈部肿瘤中均发现了肿瘤干细胞的存在。
　　 Notch信号通路作用非常广泛，其在调控干细胞增殖、诱导分化等方面发挥着非常重要作用。例如，哺乳动物中枢神经系统的发育是通过Notch-Hes信号转导系统介导的，Notch信号主要维持神经干细胞的自我更新能力。此外，Notch-Hes信号还可以直接或间接作用于乳腺干细胞，促进乳腺干细胞向各种特殊类型肌上皮细胞分化和增殖。然而现在也有许多研究表明Notch信号通路的作用也是两面的，在促进细胞增殖的过程中，也可造成Notch信号的突变而发生异常的表达，并与一些肿瘤的发生密切相关。Notch信号不仅能够直接诱导肿瘤的生成，促进细胞抗凋亡和耐药，而且Notch可以通过与Wnt、Sox及NF-κB等信号通路的相互作用以间接的方式诱导肿瘤形成。目前发现食管癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌中的Notch信号通路均有异常的表达，在肿瘤组织中最常被检测到的Notch受体家族成员是Notch1。
　　 目前化疗药物繁多，而紫杉醇是近几十年来用于临床效果最好的天然抗癌药物之一，目前普遍用于治疗卵巢癌、肺癌、乳腺癌等多种实体肿瘤。其主要药理机制是包括促进微管聚合，抑制微管解聚，同时可以诱导癌细胞凋亡。然而，由于化疗药物的长期使用，造成了许多癌细胞都具有了耐药性。耐药性的产生其主要与ABC转运子(ATP-bindingcassettetransporters)家族的成员MDR1以及BCRP的过表达关系密切。高表达ABC转运子的细胞能够将药物泵出细胞膜外，抑制药物的吸收，降低了药效，该特性对于肿瘤细胞逃逸化疗具有重要作用。干细胞一方面可以通过自身高表达MDR-1或BCRP来逃逸化疗药物的杀伤作用，增起自身的抗凋亡性，另一方面能在化疗药物刺激后进一步增高MDR-1和BCRP的表达适应新的微环境，从而导致在化疗后产生更强的耐药性，乳腺癌中存在着乳腺癌干细胞，使乳腺癌易于复发并且趋于难治。
　　 本实验首先从耐药的乳腺癌细胞和乳腺癌MCF-7细胞系中分选出以CD44+/CD24-为标志的乳腺癌干细胞，检测Notch1信号通路分子在CD44+/CD24-细胞和非CD44+/CD24-细胞中的表达情况，探讨Notch1信号通路在乳腺癌干细胞耐药中的作用。其次，用表达Notch1shRNA的真核表达载体pGPU6/GFP/Neo稳定转染MCF-7细胞，诱导Notch1基因沉默，在体内和体外研究Notch1基因下调后紫杉醇对MCF-7细胞及乳腺癌干细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响，探讨其在乳腺癌干细胞耐药的机制其在乳腺癌发生发展中的作用。
　　 第一部分：
　　 Notch1在乳腺癌干细胞中的表达及对乳腺癌干细胞耐药的影响
　　 目的:探讨乳腺癌干细胞的耐药性及Notch1信号通路在乳腺癌干细胞中的表达及其相关性。
　　 方法:通过不同浓度的紫杉醇作用MCF-7细胞，采用流式细胞仪检测CD44+/CD24-细胞含量。采用免疫磁珠法从无血清培养的乳腺癌悬浮细胞中分选CD44+/CD24-细胞和非CD44+/CD24-细胞。采用RT-PCR和Westernblot技术检测Notch1在CD44+CD24-细胞和非CD44+/CD24-细胞中的表达情况。
　　 结果:乳腺癌干细胞比例随着紫杉醇的浓度升高而增多，Notch1蛋白的表达上升。分选出的CD44+/CD24-细胞约占细胞总数的7.38％，分选出的CD44+/CD24-细胞表达干细胞标志蛋白ALDH1A1。Notch1在CD44+/CD24-细胞中的表达量与非CD44+/CD24-细胞中的表达量相比，均有显著性增加(p均＜0.05）。
　　 结论:乳腺癌干细胞对紫杉醇具有耐药性，在CD44+/CD24-细胞中Notch1高表达，活化的Notch1信号通路可能有助于CD44+/CD24-(-)细胞耐药及功能的维持。
　　 第二部分：
　　 构建下调Notch1基因及其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达
　　 目的:探讨下调Notch1基因在乳腺癌MCF-7中的表达特征及作用
　　 方法:分别设计4条针对Notch1基因的shRNA，用于干扰并下调乳腺癌MCF-7细胞中目的基因的表达。以脂质体So-fastkit介导转染乳腺癌MCF-7细胞。转染后48小时，采用RT-PCR技术检测转染细胞中Notch1基因mRNA的转录水平，稳定筛选有效的Notch1shRNA质粒，Westernblot检测Notch1蛋白在乳腺癌MCF-7细胞中的表达。
　　 结果:Notch1下调前后组的Notch1mRNA水平分别为1.29±0.31、1.26±0.36、1.07±0.46、0.97±0.15、0.61±0.60、0.44±0.41，与Control组相比，Notch1-shRNA-1、Notch1-shRNA-3、Notch1-shRNA-4组Notch1mRNA表达量均下降(P＜0.05)，其中转染Notch1-shRNA-4的MCF-7细胞中Notch1mRNA表达水平低于Notch1-shRNA-1、Notch1-shRNA-2、Notch1-shRNA-3组(P＜0.05)，而NegativeControl-shRNA与对照组无统计学差异。Notch1-shRNA-4组干扰抑制效率为75.3％。Westernblot可检测到Notch1在MCF-7中的表达。
　　 结论:shRNA可明显下调Notch1mRNA和蛋白表达，干扰片段Notch1-shRNA-4组的抑制效果较好。
　　 第三部分：
　　 Notch1siRNA联合紫衫醇对乳腺癌干细胞耐药机制的研究
　　 目的:探讨下调Notch1基因表达后乳腺癌干细胞耐药的机制
　　 方法:通过筛选得到稳定下调Notch1的MCF-7细胞，克隆形成实验和CCK8实验检测紫杉醇对干扰后乳腺癌的增殖作用，Hochest33342和AV/PI双染检测乳腺癌MCF-7细胞的凋亡情况。乳腺癌干细胞球形成实验检测乳腺癌干细胞的增殖情况。流式细胞仪检测紫杉醇治疗后乳腺癌干细胞的比例。Westernblot检测ABCG2蛋白的表达。
　　 结果:下调Notch1表达后，紫杉醇对乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制作用明显，细胞凋亡比例增加，G2-M期细胞增多。乳腺癌干细胞自我更新能力降低，癌干细胞在乳腺癌细胞中的比例下降，ABCG2蛋白表达降低。
　　 结论:ABCG2可能位于Notch1信号通路的下游，通过下调Notch1蛋白，增加乳腺癌干细胞对紫杉醇的敏感性。
　　 第四部分：
　　 Notch1siRNA联合紫衫醇对裸鼠乳腺肿瘤生长抑制作用
　　 目的:探讨Noteh1siRNA联合紫衫醇抑制裸鼠体内乳腺癌干细胞增殖的机制
　　 方法:将正常组和Notch1稳定下调细胞组分别接种于去除脂肪垫的裸鼠乳腺部位，通过紫杉醇的治疗观察肿瘤生长情况。
　　 结果:Notch1下调后，紫杉醇对肿瘤的抑制性明显增加坏死增多，肿瘤体积变小，重量降低。肿瘤组织中的干细胞比例降低。Notch1信号通路中Notch1，NICD，Hes-1及ABCG2的表达减低。
　　 结论:通过下调Notch1的表达，能提高乳腺癌干细胞对紫杉醇的敏感性。

目录

声明

摘要

第一部分 Notch1在乳腺癌干细胞中的表达及对乳腺癌癌干细胞耐药的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 构建下调Notch1基因及其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 Notch1 siRNA联合紫衫醇对乳腺癌干细胞耐药机制的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分 Notch1 siRNA联合紫衫醇对裸鼠乳腺肿瘤生长抑制作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

参考文献

附录

致谢