核心岩藻糖基化调节T-B细胞相互作用机理研究

摘要

核心岩藻糖基转移酶(Fut8)是催化N-聚糖核心岩藻糖基化唯一的酶,通过蛋白质翻译后修饰的方式调节蛋白质在机体中的作用。已有研究表明,Fut8在多种自身免疫性疾病中异常表达,在免疫应答方面也发挥着重要作用。CD4+T细胞的活化受糖基化调控,参与CD4+T细胞活化的大多数分子均为糖蛋白。Fut8通过核心岩藻糖基化影响蛋白质构象、定位及表达。T细胞受体(TCR)是富含核心岩藻糖基的糖蛋白。核心岩藻糖基化通过影响TCR信号转导、细胞因子及其受体的表达进而调节T细胞的活化。适当的糖基化修饰有助于T细胞功能的维持,然而糖基化的紊乱会引起T细胞的异常活化。CD4+T细胞过度活化与系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫病的发病密切相关。相关研究已经证明,糖基化以及CD4+T细胞活化在自身免疫病的发病中均发挥着重要的作用,但核心岩藻糖基化在CD4+T细胞活化以及自身免疫病中的作用尚未完全研究清楚。
　　目的：
　　本研究通过建立Fut8基因敲除小鼠和OT-Ⅱ转基因小鼠模型,阐明核心岩藻糖基化对CD4+T细胞活化的调节机理,为自身免疫病的诊断和治疗提供依据。
　　方法：
　　(1)建立Fut8野生型(Fut8+/+)和Fut8基因敲除(Fut8-/-)小鼠模型,以及建立OT-Ⅱ转基因Fut8野生型(Fut8+/+OT-Ⅱ)和Fut8基因敲除(Fut8-/-OT-Ⅱ)小鼠模型。
　　(2)通过凝集素印记(Lectin Blot,LB)、流式细胞术(FACS)等方法检测SLE患者血清蛋白核心岩藻糖基化水平和SLE患者外周血CD4+T细胞比例。
　　(3)在Fut8+/+和Fut8-/-小鼠模型基础上,进行CD4+T细胞活化相关研究。通过ELISA、蛋白印记(Western blot)、Lectin Blot、FACS等方法,检测核心岩藻糖基化在IgG类别转换、TCR信号转导以及T细胞活化和增殖中的作用。
　　(4)在Fut8+/+OT-Ⅱ和Fut8-/-OT-Ⅱ小鼠模型基础上,通过FACS、Western Blot、ELISA等方法检测核心岩藻糖基化在TCR信号转导、T细胞活化以及T-B细胞连接形成中的调节作用。
　　结果：
　　(1)SLE患者血清蛋白核心岩藻糖基化水平显著升高,外周血CD4+T细胞比例无明显改变,但活化的细胞增多。
　　(2)Fut8-/-小鼠脾脏细胞(SPLs)核心岩藻糖基化缺失,导致实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)模型发病率降低。OVA免疫后,Fut8-/-小鼠脾脏中CD4+T细胞比例降低,IgG类别转换受到影响。Fut8-/-小鼠CD4+T细胞中ZAP70磷酸化水平降低。此外,Fut8-/-小鼠CD4+T细胞活化和增殖能力减弱。
　　(3)Fut8-/-OT-Ⅱ小鼠CD4+T细胞中ZAP70磷酸化水平下降。Fut8+/+OT-ⅡCD4+T细胞经过Fucosidase酶切后,ZAP70磷酸化水平也下降。核心岩藻糖基化缺失使T-B细胞相互作用受到阻碍。此外,与Fut8+/+OT-ⅡCD4+T细胞相比,Fut8-/-OT-ⅡCD4+T细胞活化和增殖能力均减弱。
　　结论：
　　核心岩藻糖基化的缺失显著降低CD4+T细胞的活化,并缓解Fut8-/-小鼠EAE综合征。与Fut8+/+OT-ⅡCD4+T细胞相比,在Fut8-/-OT-ⅡCD4+T细胞中,B细胞上提呈OVA323-339的主要组织相容性复合物Ⅱ(pMHC-Ⅱ)活化T细胞的能力显著减弱。此外,Fut8+/+OT-ⅡCD4+T细胞经过Fucosidase处理后,TCR信号转导能力显著降低。这些结果表明,核心岩藻糖基化是CD4+T细胞活化中TCR-pMHC-Ⅱ形成有效连接所必需的。SLE患者血清蛋白表现出高水平核心岩藻糖基化,这为寻找SLE新型诊断和治疗靶点提供了新思路。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 核心岩藻糖基化的增强与SLE患者发病相关

1．实验材料

2 实验方法

(三)结果

1．SLE患者血清中核心岩藻糖基水平显著上调

2．SLE患者外周血CD4+T细胞的核心岩藻糖基化水平明显增强

3．Fut8敲除使脾脏细胞的核心岩藻糖基缺失

4．核心岩藻糖基的缺失通过降低CD4+T细胞活化进而改善EAE症状

(四)讨论

(五)结论

第二部分 核心岩藻糖基化通过调控TCR信号转导进而影响CD4+T细胞的活化

1．实验材料

2．实验方法

(三)结果

2．核心岩藻糖基化通过调控TCR信号转导进而影响CD4+T细胞的活化和增殖

3．核心岩藻糖基化缺失影响T-B细胞连接的形成

(四)讨论

(五)结论

参考文献

综述 糖基化与T细胞活化相关研究进展

攻读学位期间发表论文情况

致谢