核基质蛋白SATB1调控乳腺癌Hedgehog信号通路及对乳腺癌干细胞自我更新的影响

摘要

背景：乳腺癌经治疗后仍出现复发、转移的原因是肿瘤细胞对现行的治疗方法抵抗。肿瘤干细胞理论认为，肿瘤中存在着不同分化阶段的细胞，其中一小群细胞具有自我更新、分化和形成肿瘤的能力，类似正常体细胞中的干细胞，称为肿瘤干细胞(tumor stem cells，TSC)，是肿瘤发生、转移和治疗后复发的根源。SATB1(special AT rich sequence binding protein，SATB1)是一种组织特异性表达的核基质结合蛋白，与核基质结合区(Matrix Attachment Region，MAR)的ATC序列相结合，参与染色质重塑、DNA甲基化、组蛋白乙酰化，调控多种基因的表达，在维持胚胎干细胞的多能干性等方面起重要作用。SATB1与肿瘤发生、浸润、转移及复发关系密切，被视为“基因组织者”。乳腺癌干细胞处在一系列复杂的信号传导通路的调控网络中，其中Hedgehog信号通路与乳腺发育、乳腺癌的发生及乳腺癌干细胞自我更新关系密切。
　　目的：探讨核基质蛋白SATB1在乳腺癌细胞中调控Hedgehog信号通路的作用及对乳腺癌干细胞自我更新能力大小的影响。
　　方法：⑴通过无血清悬浮培养法建立MCF-7癌干细胞的体外模型。⑵构建SATB1 RNAi慢病毒载体，通过慢病毒转染干涉抑制MCF-7细胞内SATB1的表达。⑶CCK-8方法检测MCF-7、MCF-7/siControl和MCF-7/siSATB1细胞增殖活力的变化。⑷通过无血清悬浮培养法建立MCF-7癌干细胞体外模型，检测相同数量的MCF-7、MCF-7/siControl和MCF-7/siSATB1细胞中富集了乳腺癌干细胞的乳腺微球体的数量及直径大小，比较3组细胞中癌干细胞自我更新能力大小。⑸采用流式细胞仪检测MCF-7、MCF-7/siControl和MCF-7/siSATB1细胞中表型为CD44+/CD24-的乳腺癌干细胞比例并进行无菌分选。⑹利用荧光定量PCR检测MCF-7、MCF-7/siControl和MCF-7/siSATB1细胞中Hedgehog信号通路的相关基因Gli-1、Gli-2和Ptch1的mRNA表达变化。
　　结果：①成功构建并包装针对人乳腺癌MCF-7细胞中SATB1 RNAi的慢病毒载体，根据不同分组在荧光显微镜下绿色荧光显示情况得出当MOI=20并添加ENi.S的感染效率最佳。采用MOI=20并添加ENi.S代替培养基的培养条件下，转染MCF-7细胞，筛选出RNAi效果最佳的MCF-7/siSATB1组进行细胞培养（荧光定量PCR显示SATB1mRNA相对表达量为0.370，抑制率，为63.00％，Mcf-7组和SATB1/GV115-RNAi#4组数据的2-△△t经t检验2组间P＜0.01，S ATB1 mRNA表达有差异;Western-blot显示蛋白相对表达量为0.522，抑制率达47.78％，MCF-7组和SATB1/GV115-RNAi#4组目的蛋白与内参比值经t检验2组间P＜0.01，SATB1蛋白表达有差异）。②CCK-8法检测MCF-7、MCF-7/siControl和MCF-7/siSATB1细胞增殖活力结果显示3组细胞孔吸光度均值分别为：MCF-7:1.749±0.104；MCF-7/siControl:1.699±0.086；MCF-7/siSATB1:1.154±0.075, MCF-7/siSATB1细胞的增殖活力是MCF-7细胞的59.74％，下降了40.26％。经单因素方差分析，MCF-7和MCF-7/siSATB1组间P＜0.01，细胞增殖活力有差别。而MCF-7/siControl组和MCF-7组间P=0.242，＞0.05，增殖活力无差异。③在建立癌干细胞体外模型的无血清悬浮培养中，富集了乳腺癌干细胞的“乳腺微球体”形成显著，第7日在倒置荧光显微镜下观察拍照并计数MCF-7、MCF-7/siControl和MCF-7/siSATB1组细胞中微球体数量和直径大小：MCF-7细胞:微球体数约127个，成球率为12.7％，直径均值约为158.00±43.34um；MCF-7/siControl细胞:微球体数约106个，成球率为10.6％，直径均值约为140.70±45.92um；MCF-7/siSATB1细胞:微球体数约为78个，成球率为7.8％，微球体直径均值约为90.99±44.23um。经x2检验结果显示3组成球率的差异有统计学意义(X2=13.008，P=0.001）。经单因素方差分析显示三组间的微球体直径大小的差异有统计学意义（F=57.973，P＜0.00）。进一步采用levene方差齐性检验3组微球体直径的方差是否相似，结果提示可以认为3组微球体直径的方差整齐（P=0.722），因此，选用LSD法进行不同处理组的两两比较，结果MCF-7、MCF-7/siControl和MCF-7/siSATB1组两两间的收缩压差值的差异均有统计学意义(P＜0.05)。将微球体直径大小分为60～100um，100～150um，150～200um，＞200um四组，采用Kruskal-Wallis H检验分析空白组MCF-7细胞、空包病毒对照组(MCF-7/siControl)、处理组(MCF-7/siSATB1)的微球体直径按上述分组分布的差异，结果显示三组间的微球体直径分布的差异有统计学意义（H=65.925，P＜0.001）。进一步采用Nemenyi法检验不同处理组两两间微球体直径的差异，结果显示MCF-7组和MCF-7/siControl对照组微球体直径分布无差别(X2=2.492，P=0.288）;MCF-7组和MCF-7/siSATB1组微球体直径分布有差别(x2=62.423，P＜0.001)，MCF-7/siControl对照组和MCF-7/siSATB1组微球体直径分布有差别(x2=38.771，P＜0.001)。④流式细胞术检测MCF-7、MCF-7/siControl和MCF-7/siSATB1中表型为CD44+ CD24-的癌干细胞比例结果：MCF-7细胞:AS-ACI=3.127±0.235％；MCF-7/siControl: AS-ACI=2.587±0.163％；MC F-7/siSATB1:AS-ACI=1.203±0.425％。MCF-7细胞经RNAi干扰抑制细胞内SATB1的表达后，其中癌干细胞所占比例较MCF-7细胞下降了61.53％。经单因素方差分析，各组数据方差齐(P=0.414)，F=33.740，MCF-7和MCF-7/siSATB1组间P＜0.01，癌干细胞比例有差异。而MCF-7/siControl组和MCF-7组间P=0.067，＞0.05，癌干细胞比例无差异。⑤荧光定量PCR检测MCF-7、MCF-7/siControl和MCF-7/siSATB1细胞Hedgehog信号通路中的关键基因Gli-1、Gli-2和Ptch1 mRNA的表达水平，结果显示：Gli-1基因在3组细胞中mRNA CT值均值为:MCF-7:28.24±0.68;MCF-7/siControl:28.12±0.73; MCF-7/siSATB1:29.51±0.55, MCF-7/siSATB1和MCF-7细胞相比表达量下降47.25％，P＜0.01，表达有差异；Gli-2基因在3组细胞中mRNA CT值均值为:MCF-7:27.91±0.46;MCF-7/siControl:26.96±0.63; MCF-7/siSATB1:28.25±0.55;表达量下降39.45％，MCF-7/siSATB1和MCF-7细胞相比P＜0.01，表达有差异；Ptch1基因在3组细胞中mRNA CT值均值为:MCF-7:25.58±0.55; MCF-7/siControl:25.36±0.61; MCF-7/siSATB1:26.72±0.52; MCF-7/siSATB1和MCF-7细胞相比，Ptch1 mRNA表达量下降43.17％，P＜0.01，表达有差异。
　　结论：逆转录慢病毒载体RNAi抑制MCF-7细胞内SATB1表达，可明显抑制MCF-7细胞增殖活力，减少MCF-7细胞中表型为CD44+CD24-的乳腺癌干细胞比例下降，导致富集乳腺癌干细胞的MCF-7细胞微球体形成能力减弱，降低了乳腺癌干细胞自我更新能力，并引起与乳腺癌干细胞自我更新密切相关的Hedgehog信号通路中的关键基因Gli-1、Gli-2和Ptch1mRNA表达量下降，显示MCF-7细胞内SATB1的表达水平与MCF-7癌干细胞关系密切，提示SATB1可能成为治疗乳腺癌的新靶点。

目录

声明

摘要

中英文对照与缩略词一览表

第1章 引言

1．1 乳腺癌概况

1．2 肿瘤干细胞理论与乳腺癌

1．3 SATB1与乳腺癌及其干细胞

1．4 Hedgehog信号通路与乳腺癌及其干细胞

1．5 本课题方法概述

1．6 统计学分析

1．7 本研究的意义

第2章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验细胞株

2．1．2 主要试剂

2．2 主要仪器

2．3 实验方法和步骤

2．3．1 实验流程图

2．3．2 细胞培养

2．3．3 慢病毒转染实验

2．3．4．慢病毒转染MCF-7细胞后SATB1表达抑制效果筛选

2．3．5 CCK-8检测MCF-7、MCF-7／siControl和MCF-7／siSATB1细胞增殖活力

2．3．6 MCF-7、MCF-7／siControl和MCF-7／siSATB1细胞“微球体”成球率及直径平均值的比较

2．3．7 MCF-7、MCF-7／siControl和MCF-7／siSATB1干细胞流式鉴定、分选

2．3．8 荧光定量PCR检测MCF-7、MCF-7／siControl和MCF-7／siSATB1细胞中Gli-1、Gli-2和Ptch1的mRNA表达水平

第3章 结果

3．1 MCF-7细胞培养及MCF-7癌干细胞无血清悬浮培养

3．2 乳腺癌MCF-7细胞慢病毒转染条件和参数预实验

3．3 慢病毒转染MCF-7细胞后SATB1表达抑制效果筛选

3．3．1 荧光定量PCR检测各转染组MCF-7细胞SATB1的mRNA表达变化

3．3．2 Western-blot检测各转染组MCF-7细胞SATB1的蛋白表达量变化

3．4 CCK-8检测MCF-7、MCF-7／siControl和MCF-7／siSATB1细胞增殖活力

3．5 MCF-7、MCF-7／siControl和MCF-7／siSATB1细胞“微球体”成球率及直径均值的比较

3．5．1 各组间微球体成球率的比较

3．5．2 各组间微球体的直径大小分布比较

3．6 MCF-7、MCF-7／siControl和MCF-7／siSATB1干细胞流式鉴定、分选

3．7 荧光定量PCR检测MCF-7、MCF-7／siControl和MCF-7／siSATB1细胞中Gli-1、Gli-2和Ptch1的mRNA表达水平

3．7．1 QRT-PCR检测3组细胞Hedgehog信号通路Gli-1mRNA表达水平

3．7．2 QRT-PCR检测3组细胞Hedgehog信号通路Gli-2mRNA表达水平

3．7．3 QRT-PCR检测3组细胞Hedgehog信号通路Ptch1mRNA表达水平

第4章 讨论

4．1 乳腺癌干细胞与乳腺癌

4．2 乳腺癌干细胞鉴定和自我更新能力比较

4．3 SATB1与乳腺癌及其干细胞

4．4 Hedgehog信号通路与乳腺癌及其干细胞

4．5 本研究的不足

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述 调控乳腺癌干细胞信号转导通路的研究进展