mTOR特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

摘要

研究目的:
　　构建并筛选可表达 mTOR基因特异性 siRNA的慢病毒,并在此基础上采用巨噬细胞特异性启动子联合重组酶表达基因构建可在巨噬细胞内特异表达siRNA的慢病毒表达载体,为后续体内外研究其抗 Mtb感染的效果及机制奠定基础。
　　研究方法:
　　1.根据 mTOR基因的 mRNA序列选择3条靶序列,根据每条靶序列按siRNA设计原则设计相应的 shRNA,同时根据其中一条 shRNA序列设计一条长度及碱基组成与之完全一致,但碱基顺序被随机打乱的序列作为对照 shRNA序列。针对每条 shRNA各设计一对单链寡聚脱氧核苷酸,经缓慢退火后形成可表达相应 shRNA的双链 DNA,通过限制性内切酶 HpaⅠ和 XhoⅠ克隆入慢病毒表达框架质粒 pSicoR中,获取 pSicoR-mTOR干扰质粒并命名为 pSM系列载体。转化大肠杆菌 DH5α后,筛选阳性克隆、提取质粒,经酶切鉴定正确后进行 DNA测序。
　　2.将重组慢病毒表达载体(pSM系列质粒)、慢病毒包装质粒 psPAX2、包膜蛋白质粒 pMD2.G按照一定比例混合共转染293T细胞,收集含有慢病毒颗粒的上清液,超滤离心,浓缩病毒颗粒。将慢病毒颗粒感染293T细胞,利用逐孔稀释法在倒置荧光显微镜下检测荧光表达情况,并计算病毒的滴度。采用适当滴度的慢病毒颗粒感染小鼠巨噬细胞 RAW264.7,48h后,观察慢病毒颗粒感染RAW264.7细胞的情况。采用实时荧光定量 PCR和 Western blot检测巨噬细胞内mTOR基因表达的变化。
　　3.利用 PCR技术从质粒 Cre-Amp中扩增出重组酶表达基因 Cre,克隆至质粒 pBudCE4.1-SP146的 Hind III/Xba I位点中,获得重组质粒 pBudCE4.1-SP146-Cre,酶切鉴定正确后送测序。
　　4.采用 PCR技术分别扩增获取 SP146-Cre片段、pSico的0至3808片段以及 pSico的3783至7566片段,然后利用 In-Fusion克隆技术将 SP146-Cre克隆至 pSico中。将重组载体 pSico-SP146-Cre转化大肠杆菌后选取阳性克隆菌,采用菌落 PCR方法进行重组质粒鉴定,鉴定成功后送测序验证。
　　5.将 SP146启动子调控的质粒 pSico-SP146-Cre分别转染293T、RAW264.7细胞,通过 SP146启动子调控 Cre/LoxP系统情况下,通过绿色荧光的表达模式观察评价巨噬细胞特异性启动子的特异性以及 SP146调控下的 Cre/LoxP系统的功能。
　　研究结果:
　　1.酶切及测序的结果显示,mTor特异性 siRNA表达序列及对照序列均正确插入到质粒 pSicoR中,成功构建了 mTOR基因特异性的 siRNA慢病毒表达载体pSM1, pSM2, pSM3及对照 siRNA表达载体 pSM4。
　　2.利用293T细胞包装重组慢病毒表达载体 pSM1/2/3/4,生产出慢病毒颗粒后进行病毒浓缩,经病毒滴度测定,四组慢病毒 lenti-pSM1/2/3/4的滴度分别是6×106TU/ml、1×106TU/ml、4×106TU/ml、2.5×106TU/ml。四种重组慢病毒颗粒感染 RAW264.7细胞,48h后均可观察到明亮的绿色荧光,表明重组慢病毒能有效感染 RAW264.7细胞。
　　3.实时荧光定量 PCR及 Western blot检测的结果相一致,均证实了lenti-pSM1组、lenti-pSM2组、lenti-pSM3组的 mTOR mRNA及蛋白表达均受到抑制,其 mTOR mRNA表达水平的抑制率分别是24.1％、59.3%、41.1%,蛋白表达水平与空白对照组(0.9567±0.021)及 lenti-pSM4组(0.9200±0.030)相比三实验组的灰度值分别为:0.9033±0.025、0.883±0.031、0.893±0.032,其中lenti-pSM2组为最佳干扰效果组。
　　4.菌落 PCR及测序结果证实,MФ特异性启动子序列 SP146及 Cre基因片段已成功插入质粒 pSico中,成功构建了慢病毒表达载体 pSico-SP146-Cre。将该重组载体及转染入293T及 RAW264.7细胞,观察到其在293T细胞中有很强的绿色荧光,但是在 RAW264.7细胞中几乎没有绿色荧光。
　　结论:
　　1.成功构建了针对 mTOR基因干扰序列的系列慢病毒表达载体 pSM。
　　2.完成了慢病毒的包装和浓缩,成功地利用构建的重组慢病毒载体生产的慢病毒颗粒感染了 RAW264.7细胞,并筛选出 mTOR shRNA2为最有效的干扰序列。
　　3.成功构建了携带 MФ特异性启动子序列 SP146、重组酶 Cre基因的慢病毒表达载体 pSico-SP146-Cre。
　　4. SP146启动子具有良好的 MФ特异性,可调控 Cre/LoxP系统,为后续动物水平的实验研究奠定基础。

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中英文缩略词表

第 1 章 引言

第 2 章 mTOR 特异性 shRNA 表达慢病毒的构建及筛选

2.1 概述

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.3 结果

2.3.1 重组慢病毒载体 pSM1/2/3/4 的构建及其鉴定

2.3.2 重组慢病毒包装及病毒滴度的测定

2.3.3 重组慢病毒感染 RAW264.7 细胞的荧光表达

2.3.4 实时荧光定量 RT-PCR 检测 RAW264.7 细胞中 mTOR 的表达

2.3.5 Western blot 检测 RAW264.7 细胞中 mTOR 的表达

2.4 讨论

第 3 章 巨噬细胞特异性慢病毒表达载体 pSico-SP146-Cre的构建与鉴定

3.1 概述

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.3 结果

3.3.1 质粒 pBudCE4.1-SP146-Cre 的构建及其鉴定

3.3.2 慢病毒表达载体 pSico-SP146-Cre 的构建及其鉴定

3.3.3 慢病毒表达载体转染后荧光的表达

3.4 讨论

第 4 章 全文小结

4.1 概述

4.2 主要的研究结论

4.3 本课题创新之处

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综 述