秦岭山脉华溪蟹属淡水蟹类的DNA条形码研究及淡水蟹线粒体基因组的初步分析

摘要

目的：
　　1.尝试运用DNA条形码鉴别秦岭山脉华溪蟹属（Sinopotamon）淡水蟹类，以探讨DNA条形码在华溪蟹属淡水蟹中的适用性，同时初步揭示大型山脉在淡水蟹类群分布中具有阻隔作用抑或充当走廊。
　　2.获取我国特有修水华溪蟹（Sinopotamon xiushuiense）、黎川华南溪蟹（Huananpotamon lichuanense）线粒体全基因组；运用短尾下目线粒体全基因组数据进行系统发生分析，探讨淡水蟹在短尾下目中的分类地位及亲缘关系、分化时间及进化过程中受到的选择压力。
　　方法：
　　1.选择秦岭山脉南北侧采集样本，进行形态学鉴定。选择COI及ITS2基因作为DNA条形码候选标准序列，提取样本的总DNA，经PCR扩增及测序，获得实验数据，结合GenBank已有华溪蟹属数据，共同组成数据集。经数据筛选及检验，做遗传距离及系统发生分析。
　　2.检索GenBank数据库，下载已有短尾下目线粒体全基因组数据。获取中国特有修水华溪蟹、黎川华南溪蟹线粒体全基因组，分析其基因组特征，将碱基组成、基因组成及排列、密码子利用情况等特征与其它短尾类比对；依据线粒体蛋白质编码基因产物在线粒体呼吸链中执行的功能，将13个蛋白质编码基因分为4组（复合体I，复合体III，复合体IV，复合体V），结合2个rRNA基因，分别进行系统发生分析；使用BEAST软件估算短尾下目各类群的分化时间；使用PAML软件分别计算13个蛋白质编码基因的平均选择压力，使用分枝模型分别计算淡水蟹类群及其它短尾类的选择压力，计算结果均进行LRT（Likelihood Ratio Test）显著性检验。
　　结论：
　　1.基于COI基因构建的系统发生树可明确鉴别凹肢华溪蟹(S.depressum)、福建华溪蟹(S.fukienense)、光泽华溪蟹指名亚种(S.davidi davidi)、兰氏华溪蟹(S. lansi)、长江华溪蟹指名亚种(S.yangtsekienseyangtsekiense)。
　　2.本研究涉及的华溪蟹类群中“DNA条形码间隙”的差异现象依然存在：长安华溪蟹(S.changanense)与尖叶华溪蟹(S.acutum)聚为一支，结合两物种的种内种间遗传距离存在重叠，即这两个物种间的条形码间隙消失；长江华溪蟹桐柏亚种（S.yangtsekiense tongbaiense）、陕县亚种（S.yangtsekiense shanxianense）与陕西华溪蟹(S.shensiense)共同聚为一支，且种内种间遗传距离出现重叠。
　　3.长安华溪蟹及尖叶华溪蟹基本按照采样点位置以秦岭为界分为南北两支，提示秦岭山脉在一些华溪蟹物种迁移活动中具有阻隔作用。
　　4.ITS2基因获取效率低，双峰序列占比较高（37.97％），本研究不支持其作为DNA条形码标准序列。
　　5.修水华溪蟹线粒体基因组全长18460bp，黎川华南溪蟹线粒体基因组全长15380 bp，均编码了后生动物常见的37个基因。与泛甲壳动物（Pancrustacean）原始排列相比，两种淡水蟹均出现两处特异性tRNA重排（tRNAHis和tRNAGln），该重排此前仅出现在汉氏泽蟹中，在基因组层次支持溪蟹总科的单系性。
　　6.使用复合体V（ATP6和ATP8）及复合体III（CYTB）构建的系统发生树与当前分类体系有较大差异，且各分支置信度极低，不适宜作为高阶元系统发生分析的分子标记。其它三组均显示出与当前分类体系较一致的结果，且置信度较高，提示后期可在这些基因中寻找分子标记。
　　7.基于线粒体13个蛋白质编码基因的分歧时间估算显示：短尾下目约发生于三叠纪早期（约254.41Ma），而淡水蟹中的溪蟹总科分化于约133.58Ma。
　　8.复合体IV（COX1~III）及复合体III（CYTB）受到较强的选择压力，而复合体I（ND1~6，ND4L）及复合体V（ATP6，ATP8）受到较弱的选择压力；除ATP6及ND4L基因外，淡水蟹的11个蛋白质编码基因dN/dS值均大于其它海洋蟹（差异显著），更多非同义替换的积累提示淡水蟹出现对陆地环境的适应性进化。

目录

声明

第1章 引言

1.1 秦岭-淮河线及秦岭山脉的自然地理概述

1.2 秦岭-淮河线相关地区华溪蟹类概况

1.3 蟹类分类学研究概况

1.4 DNA条形码及其在淡水蟹中的应用

1.5 短尾下目系统发生研究概况

1.6 短尾下目线粒体基因组研究概况

第2章 秦岭山脉华溪蟹属（Sinopotamon）淡水蟹DNA条形码研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第3章 基于线粒体全基因组的淡水蟹系统发生分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 数据分析

3.4 实验结果

3.5 讨论

第4章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:短尾类线粒体基因组研究概要及比较分析