蛋鸡血管瘤型禽白血病诊断方法的建立及应用

摘要

血管瘤型禽白血病(Hemangioma of Avian Leukosis)主要是由禽白血病病毒引起的在鸡皮肤和内脏器官的表面形成以血疱为特征的病变。近年来禽血管瘤在我国发病严重，主要在蛋鸡开产期前后发病，导致产蛋率下降，死淘率最高能达到20％，给我国的养鸡业造成巨大的经济损失。
　　 禽白血病、网状内皮组织增生症、马立克病和鸡传染性贫血是鸡群中常见的免疫抑制病。它们除了在鸡体内能够产生各自的病变，还常以亚临床感染的形式感染鸡群，造成免疫抑制，干扰鸡群对新城疫和禽流感疫苗的免疫效果，继发细菌感染。目前只有马立克病能通过疫苗成功的进行预防，其余的只能通过定期对鸡群进行监测，淘汰感染鸡来加以控制。
　　 本研究通过建立禽白血病毒A、B、J亚型以及MDV、REV、CIA的PCR诊断方法来研究蛋鸡血管瘤发病的主要原因，并对典型的肿瘤病料进行检测，调查免疫抑制病混合感染的情况。主要研究内容如下：
　　 一、蛋鸡血管瘤诊断方法的建立
　　 参照文献资料和GenBank发表的禽白血病病毒的A、B、J亚型标准毒株RAV-1、RAV-2、HPRS-103序列，针对env基因易变区分别设计出针对禽白血病毒A、B、J亚型的诊断引物，扩增的基因片段长度分别为387bp、255bp、439bp，将ALV的目的片段连接到PMD-18T载体上，转化到DH5a上，克隆、鉴定、测序。参考文献资料合成了MDV、REV、CAV的诊断引物，用阳性毒株对各引物的反应条件进行优化。本研究建立了鉴别诊断ALVA、B、J亚型的PCR方法，该方法特异性良好，灵敏度高；同时也分别建立了MDV、REV和CAV的PCR诊断方法，这为血管瘤型禽白血病的诊断奠定了基础。
　　 二、蛋鸡血管瘤型J亚型禽白血病毒的分离和gp85序列分析
　　 为了研究引起蛋鸡血管瘤发病的主要原因，本研究通过临床观察、剖检、接种DF-1细胞，用IFA和该研究所建立的PCR方法对14份典型血管瘤病料进行诊断，发现其中的10份病料是由J亚型禽白血病毒引起，且IFA检测为阳性，合成J3/J4引物，将gp85片段扩增、测序，对gp85进行序列分析。结果表明：10株病毒与国内外核苷酸序列的同源性在87.5％～96.8％之间，10株之间的核苷酸同源性在88.7％～96.4％；推导的氨基酸与国内外毒株的同源性78.0％～96.9％之间；遗传进化分析表明，广西分离株的亲缘关系比较远，PD-108与HPRS-108比较近，且同一地区的亲缘关系也比较远。
　　 三、建立诊断方法的临床应用
　　 应用建立的禽白血病病毒A、B、J亚型和MDV、REV、CAV的PCR诊断方法，对于2009年11月-2011年3月对40个鸡群的患肿瘤病鸡只中，采集肝脏、脾脏和血清共210份病料进行检测，结果发现禽白血病在蛋鸡中存在率比较高，禽白病和MDV的混合感染占17.5％，在蛋鸡中且以J亚型禽白血病流行为主，ALV+MDV+REV和REV+MDV+CAV的三重感染为2.5％，ALV+MDV+REV+CAV四重感染为2.5％，通过调查发现免疫抑制病混合感染普遍存在。