H9N2亚型禽流感病毒冷适应致弱活疫苗候选株的培育及冷适应表型相关基因确定

摘要

H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属于低致病性，但能引起家禽较为严重的疫病，特别是混合感染，导致较高的死亡率。该病毒又可作为其它亚型的流感病毒的供体，形成新的重组病毒。目前国内主要采取的预防和控制措施是接种疫苗，而在病毒流行与进化过程中，很容易产生抗原变异，导致疫苗的研制速度跟不上抗原变异的速度，因此有必要研制更加有效的疫苗。冷适应是一种较安全的致弱方法，既保留好的抗原性，又刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。本研究利用H9N2亚型AIV流行株培育了一株冷适应毒株，构建了反向遗传操作系统，鉴定出冷适应表型相关基因，评价了冷适应毒株的免疫效力，为流感病毒疫苗的研制奠定基础。
　　1.H9N2亚型禽流感病毒冷适应毒株的培育及其生物学特性
　　选取H9N2亚型AIV A/chicken/TaiXing/1/2008（TX株），在鸡胚上从37℃进行连续梯度降温传代，每个温度传代8-10次，最终使病毒能够在25℃下稳定的复制，病毒血凝(hemagglutination，HA)效价达到10 log2。冷适应性(Ca)和温度敏感性(Ts)试验证实，冷适应毒株具备Ca特性，最适培养温度为33℃。为分析冷适应过程中的氨基酸位点变化，通过PCR扩增了冷适应毒株的8个片段基因，并进行测序，与母本毒株的序列对比结果表明，各个片段都发生不同程度的突变，位点主要位于HA、PB2、PB1、PA、NP片段。体外增殖实验表明，冷适应毒株在CEF细胞中能复制，但在MDCK细胞中不能够正常复制。同时，在小鼠致病性试验中发现TX毒株在冷适应过后不能够引起小鼠的体重下降，试验表明冷适应过程使病毒的毒力显著降低。
　　2.H9N2亚型禽流感病毒冷适应减毒株的免疫效力评价
　　为了评价H9N2亚型AIV冷适毒株作为疫苗候选株的潜力。106 EID50的病毒经人工滴鼻、点眼感染SPF鸡，试验表明冷适应毒株失去了接触传播能力，但是在气管组织中能够低水平复制。冷适应毒株和NS缺失毒株以106EID50剂量滴鼻、点眼途径免疫4周龄SPF(specific pathogen free)鸡，TX毒株经过灭活以相同剂量肌肉注射免疫。NS缺失毒株rTX-NS1-128在一次免疫后能够诱导鸡产生较高的血凝抑制价（8.45 log2），能较好抵御同源（TX株）或异源（F98株）H9N2亚型禽流感病毒的攻击，保护率达到80％以上。而冷适应毒株及TX灭活疫苗一次免疫产生的血凝抑制价只有7.0log2上下，保护率约60％。与NS缺失疫苗株相比都较低，需要加强免疫才能获得较好的免疫效果。
　　3.H9N2亚型禽流感病毒冷适应株冷适应表型相关基因测定
　　为了鉴定所培育的H9N2亚型AIV冷适应毒株与冷适应相关的关键基因，PCR扩增TX-25-CE30毒株的8个基因，并与pHW2000表达载体相连，构建出8个基因的表达质粒。利用PR8骨架，将冷适应毒株各基因的表达质粒逐一替换或组合替换PR8的相应基因，转染MDCK和293T细胞，共获得12个重组病毒。对重组病毒进行的冷适应特性试验表明NP、PB1和PB2片段中氨基酸的突变会引起冷适应特性，其中NP片段起关键作用。对NP片段进行进一步定位，发现NP片段中18位甘氨酸突变为谷氨酸能够使病毒在低温下复制。

目录

摘要

符号说明

综述 A型流感病毒反向遗传操作系统与疫苗研究进展

第一章 H9N2亚型禽流感病毒冷适应毒株的培育及其生物学特性

1 材料

2 方法

3 结果

4．讨论

参考文献

第二章 H9N2亚型禽流感病毒冷适应减毒活疫苗的免疫效力评价

1 材料

2 方法

3 结果

4．讨论

参考文献

第三章 H9N2亚型禽流感病毒冷适应株主要冷适应表型基因测定

1 材料

2．方法

3．结果

4．讨论

参考文献

全文小结

致谢

声明