修饰的MDCK细胞悬浮培养驯化及用于繁殖禽流感病毒的初步探究

摘要

禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)根据其致病性可分为高致病性禽流感(HPAI)和低致病性禽流感(LPAI)病毒，通常HPAIV对家禽表现为高致死率，而LPAIV对家禽的致病表现为从无症状到轻微症状，但是传播范围广，常常导致混合感染而使死亡率上升。当前流行的禽流感病毒主要包括H5、H7和H9亚型，可以跨种间传播，甚至传播给人，对公共卫生产生巨大威胁。疫苗接种是预防流感大流行的主要策略，目前大多数季节性流感疫苗都是用鸡胚生产，需要大量的人力和物力，在大流行期间很难放大生产，如果爆发高致病性禽流感(HPAI)病毒（如H5N6、H7N9病毒），很难在短时间大量供应SPF鸡胚。目前有多个细胞系可以用于繁殖流感病毒，常用的有MDCK、Vero细胞等，其培养过程简单、增殖迅速、病毒产量高。然而MDCK细胞培养也面临两方面的问题:一是MDCK细胞贴壁性太强，无法适应工业化生产;二是与鸡胚培养相比，禽流感病毒在细胞上的繁殖能力不高。有研究通过对细胞进行修饰，改变其生物学特性来解决上述问题。研究表明TIGAR(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator)基因能够减少各种应激引起的凋亡，提高细胞存活时间。唾液酸转移酶(siat7e)基因是控制细胞贴壁程度的重要基因之一，β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶(ST3GAL4)基因编码的产物能提高宿主细胞对禽流感病毒的敏感性。实验室前期已经构建了稳定表达TIGAR基因的MDCK细胞(TG-418-E5)，和稳定共表达Siat7e基因和ST3GAL4基因的MDCK细胞(M54)，因此，本研究通过对两个修饰的MDCK细胞进行驯化，使之适应无血清全悬浮培养，并用于增殖禽流感病毒。
　　1、TG-418-E5细胞和MDCK-siat7e-ST3GAL4(M54)细胞悬浮培养的驯化
　　在细胞没有悬浮驯化的情况下，先使用微载体来悬浮培养TG-418-E5细胞，分析初始细胞接种密度、微载体浓度和换液方式对细胞生长的影响，以确定在使用微载体悬浮培养时的最佳的培养条件，同时分析降低培养基中血清浓度对细胞状态的影响。研究表明TG-418-E5细胞在微载体悬浮培养的情况下，当微载体浓度为3g/L、细胞初始接种密度为30×104/mL时，培养48h进行半换液、72h进行全换液，96h活细胞密度(viable cell density，VCD)可达310×104个/mL以上。与母本MDCK细胞相比，在含有5％血清培养基或低血清培养条件下，TG-418-E5细胞在微载体上的最大活细胞的密度高了将近23.5％（约40×104个细胞），但是在降血清过程中，两种细胞都出现拉丝，细胞轮廓不清晰，生长比较缓慢等情况，因此都不适合进行无血清驯化。M54细胞是进行贴壁性能修饰的MDCK细胞，通过单细胞悬浮驯化、逐渐降低血清浓度的方法，获得一个悬浮细胞株M54x。我们比较了M54x不同细胞初始密度对活细胞数和细胞上清中的葡萄糖、乳酸浓度的影响。结果表明M54x细胞的最佳接种初始密度是60×104cells/mL,细胞生长密度最高，生长速率最快，细胞上清中葡萄糖浓度较高而乳酸浓度较低，细胞高峰密度可达到420×104cells/mL。而在72h，细胞处于对数生长期，细胞状态较好，72h之后细胞上清中葡萄糖浓度较低而乳酸浓度越来越高，所以72h是一个临界点，细胞上清中葡萄糖浓度和乳酸浓度不会影响病毒增殖，因此72h是病毒最佳接种时间。由于微载体的使用大大增加成本，最经济实用安全的方法是低血清悬浮培养，因此选择M54x细胞做低血清悬浮培养驯化是更好的选择。
　　2、TG-418-E5细胞与M54悬浮细胞用于增殖禽流感病毒的初步探究
　　本研究中利用摇瓶培养系统和BIOSTATA生物反应器，比较了H5亚型YA-5、R2344和H7N9rGW三个禽流感疫苗候选株在这两种细胞上的生长情况，确定病毒在不同培养体系的最佳接种时间、接种量、最佳胰酶浓度和最佳收获时间。TG-418-E5细胞用微载体最佳条件培养，培养后72h病毒HA效价达到最高值;与MDCK细胞相比，病毒HA效价提高了1-2个滴度，但是该细胞利用微载体悬浮培养无法适应低血清悬浮培养，因此未做放大培养研究。我们在摇瓶中无血清悬浮培养M54x细胞，分别比较不同的MOI、TPCK-胰酶浓度和温度对禽流感病毒增殖的影响，发现33℃培养、MOI为0.0001、TPCK-胰酶浓度为5μg/mL是最佳病毒感染条件。将3种禽流感疫苗株(H5亚型YA-5、R2344和H7亚型rGW)接种M54x悬浮细胞，72～96h后收获病毒，病毒血凝效价HA分别可达9、8、9log2/50μL。在BIOSTATA反应器培养体系中，初步探索M54x细胞繁殖禽流感病毒的工艺参数:培养72h后半换液，加入TPCK-胰酶至终浓度为5μg/mL，按0.0001MOI接种3种禽流感疫苗株(H5亚型YA-5、R2344和H7亚型rGW)，同时设定生物反应器各项参数。病毒培养72h～96h之间收获（每6h取样观察病变、测上清HA效价）产量最高。H5亚型YA-5在76h收获，HA效价可达9log2/50μL;H5亚型r2344在66h收获，HA效价为9log2/50μL;H7亚型rGW在72h收获，HA效价是9log2/50μL。这个结果说明M54x细胞系具有无血清悬浮培养生产禽流感病毒疫苗的潜能。本试验成功建立了M54x悬浮细胞系并且能够稳定高效繁殖禽流感病毒，为禽流感疫苗生产中采用无血清无蛋白、无动物源性培养基，生物反应器规模化培养M54x细胞生产禽流感病毒提供了一定的实验依据。

目录

摘要

符号说明

第一章 综述：MDCK细胞系的修饰和应用

1．MDCK细胞

2．MDCK细胞的培养方式

2．1 传统培养方式

2．2 无血清贴壁培养

2．3 微载体细胞悬浮培养法

3．MDCK细胞系的修饰

3．1 稳定表达人Siat7e基因的MDCK全悬浮细胞系的建立

3．2 稳定表达TMPRSS2的MDCK细胞系

3．3 稳定表达TIGAR基因的MDCK细胞系

4．小结

参考文献

第二章 两种修饰的MDCK细胞系悬浮培养的驯化

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果

2．1 TG-418-E5细胞微载体悬浮驯化

2．2 M54细胞无血清全悬浮驯化

3．讨论

第三章 两种修饰的MDCK细胞用于增殖禽流感病毒的初步探究

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果

2．2 TG-418-E5与母本MDCK细胞(5-TG、5-MDCK)在低血清培养基中的接种病毒情况比较

2．3 接种M54x悬浮细胞的病毒感染量，TPCK-胰酶浓度以及感染温度

2．4 禽流感疫苗在摇瓶培养的M54x细胞中的增殖情况

2．5 反应器增殖禽流感疫苗株

2．6 禽流感病毒在不同培养方式中的生长情况

3．讨论

参考文献

全文总结

致谢

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