鸡马立克氏病病毒Meq蛋白特异性单克隆抗体研制及其初步应用

摘要

本文主要从以下几方面进行论述：
　　1.抗鸡马立克氏病病毒Meq蛋白特异性单克隆抗体研制
　　本研究根据NCBI中已发表的MDV-RB1B-Meq序列，设计合成一条特异性引物，用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出特异性的Meq片段。利用EcoRⅠ和XbaⅠ两种限制性内切酶对Meq基因和Pcold-TF空载体进行酶切，将两者酶切产物进行连接，转化至BL21大肠杆菌，筛出阳性表达菌，获得重组质粒Pcold-TF-Meq。酶切分析、SDS-PAGE和Westernblotting鉴定的结果表明:构建的Pcold-TF原核表达载体正确，基因序列分析结果与预期完全一致。转染BL21原核表达细菌通过大量诱导，并裂解细菌，结果在上清中获得大量表达的MDV-RB1B-Meq重组蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳和Wenstern Blot鉴定，结果在77 Kda分子量有一特异性条带。切取该特异性蛋白条带作为免疫原，对Balb/cc小鼠进行4次免疫，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0进行细胞融合，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光(IFA)检测杂交瘤细胞上清，结果成功获得了一株对Meq蛋白具有特异性的杂交瘤细胞，命名为MDV-5F4。经2次亚克隆，杂交瘤细胞达到100％分泌抗MDV-Meq蛋白特异性抗体。酶联免疫吸附实验(ELISA)对MDV-5F4进行亚类鉴定，结果表明该单抗亚类为IgM。该单抗的成功研制，为MDV性肿瘤鉴别诊断提供了条件。
　　2.抗MDV-Meq蛋白单克隆抗体的初步应用
　　家禽肿瘤病主要有马立克病，禽白血病，网状内皮细胞增生症以及不明原因的其他肿瘤性疾病。为了在临床上快速鉴别肿瘤的病原，本研究利用自行研制的抗MDV-Meq的特异性单克隆抗体MDV-5F4、实验室保存的抗MDV gB蛋白的单克隆抗体MDV-BD8、抗禽白血病病毒特异性单克隆抗体ALV-5D3和抗网状内皮细胞增生症病毒的单克隆抗体REV-6C12，建立了快速检测MDV、ALV和REV等三种病原性肿瘤快速鉴别的免疫组织化学检测方法和间接免疫荧光法(IFA)。研究结果表明，该方法可以用于临床马立克氏病病毒(MDV)和禽白血病病毒(ALSV)强毒感染鸡的肿瘤组织快速的检测，对于3种肿瘤疾病的鉴定具有较好的应用前景。

目录

摘要

符号缩写

文献综述

1．概述

2．马立克病毒的概况

2．1 马立克病毒的分类地位

2．2 马立克病毒的形态和理化特性

2．3 病毒的基因组结构

2．4 基因组编码的蛋白及其功能

3．马立克病的概述

3．1 流行病学

3．2 临床症状

4．马立克氏病的实验室诊断

4．1 病毒的分离培养

4．2 病毒抗原的检测

4．3 聚合酶链反应(PCR)技术

4．4 DNA探针技术

5．禽马立克氏病的预防与控制

6．Meq基因研究进展

7．免疫组织化学(IHC)概述

研究目的和意义

研究内容一 鸡马立克氏病病毒Meq蛋白特异性单克隆抗体研制

1．材料

1．1 病毒、细胞

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器及耗材

2．方法

2．1 CEF的制备

2．2 病毒的增殖

2．3 DNA的提取

2．4 PCR扩增

2．5 原核表达载体的构建

2．6 Meq蛋白原核表达条件优化

2．7 免疫原的制备

2．8 免疫方法及免疫程序

2．9 细胞融合

3．0 酶联免疫吸附法(ELISA)筛选阳性杂交细胞

3．1 间接免疫荧光法(IFA)单克隆抗体检测

3．2 阳性杂交瘤细胞的亚克隆

3．结果

3．1 PCR扩增MDV-Meq基因的结果

3．2 Pcold-TF-Meq的构建与鉴定

3．3 阳性杂交瘤细胞的筛选

3．4 间接免疫荧光法(IFA)单克隆抗体检测

3．5 亚类鉴定

4．讨论

参考文献

研究内容二 家禽肿瘤的快速鉴别方法建立

1．材料

1．1 病毒、实验动物

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器及耗材

2．方法

2．1 人工感染实验

2．2 冰冻切片及石蜡切片的制备

2．3 冰冻切片免疫荧光(IFA)方法初步建立

2．4 石蜡切片免疫组化(IHC)方法初步建立

2．5 冰冻切片免疫荧光(IFA)初步应用

3．结果

3．1 实验感染鸡病理组织学观察结果

3．2 MDV冰冻切片间接免疫荧光(IFA)检测

3．3 ALV冰冻切片间接免疫荧光(IFA)检测

3．4 石蜡切片免疫组化(IHC)检测

3．5 临床肿瘤检测分析

4．讨论

参考文献

全文总结

致谢

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