慢病毒介导的ICAM-1基因沉默治疗大鼠肾移植模型急性排斥反应的实验研究

摘要

本研究分为三部分： 第一部分：大鼠同种异体肾移植模型的建立 目的：建立一种稳定、可靠、实用的大鼠同种异体肾移植急性排斥反应模型。 方法：1．采用移植肾置于左侧，供肾原位低温灌洗；移植肾带主动脉瓣与受体腹主动脉端—侧吻合；供体左肾静脉连其上方下腔静脉断端与受体下腔静脉端—侧吻合；供体输尿管带膀胱瓣与受体膀胱吻合。2．技术熟练后，行Wistar→SD大鼠肾移植，随机分为2组（每组12只）：A组（排斥组），不作任何治疗；B组（CsA治疗组），术后使用CsA10d。两组均行病理检查和观察生存期。 结果：1．经过3个月的练习，建立了比较稳定的大鼠同种异体肾移植模型。手术成功率可达到90%。2．A组平均存活7．33d；B组平均存活21．2d。术后7天病理检查示A组出现明显的急性排斥反应。 结论：此模型较容易掌握，除常规显微外科器械外不需要特殊的器械或设备。 第二部分：携带大鼠ICAM—1基因RNA干扰慢病毒载体的构建、体外鉴定与初步体内实验 目的：1．构建携带大鼠ICAM—1 RNA干扰的重组慢病毒。2．筛选出基因抑制效率最高的重组慢病毒。3．研究慢病毒载体体内转染主要脏器的有效性。 方法：1．根据基因序列，设计并合成针对4个靶点的寡核苷酸，制备双链DNA oligo； HpaⅠ和XhoⅠ酶切pGCL—GFP载体以使其线性化，将其与双链DNA oligo在DNA连接酶作用下进行连接反应，将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，PCR筛选获得阳性克隆并进行基因测序。2．将重组载体与病毒包装质粒共转染人胚肾293 T细胞，获得的病毒颗粒经浓缩后测定滴度。3．通过重组慢病毒体外转染NRK细胞，以RT—PCR和Western Blot法筛选出基因抑制效率最高的重组慢病毒，并将其再次扩增、浓缩后测定滴度。4．SD大鼠静脉注射不同浓度重组慢病毒，分别于96小时、25天后检测报告基因表达情况。 结果：1．经过酶切、连接、转化后获得阳性克隆：基因测序结果完全正确。2．获得的针对4个靶点的重组慢病毒，经RT—PCR和Western Blot法证实，3#病毒在MOI=50时，基因抑制率即达到88．4%。3．大鼠体内实验表明，20×108 TU重组慢病毒可有效转染各主要脏器，转染25d后大鼠肾组织仍在不断表达报告基因。 结论：1．成功构建了含有GFP报告基因的大鼠ICAM—1 RNA干扰慢病毒载体。2．体外实验证实了该慢病毒载体能高效转导NRK细胞，并能有效阻断目的基因的表达。3．体内实验初步确定了该慢病毒载体的有效性。 第三部分：慢病毒介导的ICAM—1基因沉默治疗大鼠肾移植模型急性排斥反应 目的：1．研究携带大鼠ICAM—1 RNA干扰的重组慢病毒抑制移植肾ICAM—1基因表达的作用。2．探讨慢病毒介导的ICAM—1基因沉默防治大鼠肾移植模型急性排斥反应的作用效果和机理。3．初步探讨慢病毒载体结合RNA干扰应用于同种异体移植排斥的效果和前景。 方法：1．供体为Wistar大鼠、受体为SD大鼠肾移植，随机分为4组（每组12只）：a组（同系对照组）；b组（排斥组），不作任何治疗：c组（空白对照病毒组）：供体术前96小时尾静脉输注空白对照病毒20×108 TU：d组（治疗组）：供体术前96小时尾静脉输注rICAM重组慢病毒20×108 TU。2．肾移植术后观察生存期，并抽取外周血，检测肾功能，ELISA法检测血清IL—2、ICAM—1的浓度。3．肾移植术后7天取移植肾，RT—PCR和Western Blot法检测移植肾ICAM—1的表达：HE染色观察病理变化。 结果：1．肾移植术后治疗组生存期达23．8天，与b、c两组（仅为7．3、7．0天）相比有统计学差异。2．肾移植术后治疗组血清Cr、IL—2、ICAM—1的浓度与同系对照组相比无显著差别，而与b、c两组差别巨大。3．肾移植术后7天，治疗组移植肾ICAM—1表达明显被抑制。HE染色提示移植肾Banff0～ⅠA级，而b、c组移植肾BanffⅡB—ⅢA级。 结论：1．携带ICAM—1 RNA干扰的重组慢病毒可以有效地、特异性地抑制移植肾ICAM基因的表达。2．被植入经rICAM重组慢病毒转染的供肾后，受体的生存期明显延长。3．慢病毒介导的ICAM—1基因沉默治疗大鼠肾移植模型急性排斥反应效果良好，具有潜在的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要缩略词表

声明

前言

第一部分 大鼠同种异体肾移植模型的建立

材料和方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 携带大鼠ICAM-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建、体外鉴定与初步体内实验

实验材料

实验方法

结果

附图

讨论

小 结

参考文献

第三部分 慢病毒介导的ICAM-1基因沉默治疗大鼠肾移植模型急性排斥反应

材料与方法

结果

附 图

讨论

小 结

参考文献

全文总结

综述：ICAM-1与器官移植排斥

致谢