腺病毒介导的IL-1β基因沉默对大鼠脊髓损伤保护作用的实验研究

摘要

目的：
　　1.构建大鼠白细胞介素-1β（Inerleukin-1 beta，IL-1β）基因shRNA腺病毒（Ad-shIL-1β）。
　　2.探讨腺病毒介导的IL-1β基因沉默对大鼠脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）的保护及其作用的机制。
　　方法：
　　1.于美国国家生物技术信息中心查询大鼠IL1-β基因的核苷酸序列，由此设计siRNA，并合成相应shRNA。经退火处理的shRNA片段与相关干扰载体连接构建腺病毒载体穿梭质粒，随后与骨架质粒对HEK293细胞进行共转染，并进行包装与扩增。将所得腺病毒感染大鼠H9C2细胞，使用荧光显微镜观察感染情况，采用Western blot法检测IL-1β的表达情况。
　　2.将72只健康雄性SD大鼠构建大鼠SCI模型，随机分为4组：正常对照组（Sham组）：对实验动物仅施行椎板减压，而无SCI，无治疗；SCI组（Vehicle组）：SCI前7d，向T12水平脊髓注射3μl生理盐水；空载体组（Ad-GFP组）：SCI前7d，向T12水平脊髓注射3μl空病毒；和IL-1β shRNA腺病毒组（Ad-shIL-1β组）：SCI前7d，向T12水平脊髓注射3μl Ad-shIL-1β。采用荧光显微镜观察判断绿色荧光蛋白表达情况；BBB评分评估大鼠后肢运动功能情况；免疫荧光染色判断各组脊髓组织中NeuN阳性细胞的表达情况；以Western blot法检测各组脊髓组织中IL-1β、Bax、Bcl-2和裂解caspase-3蛋白的表达水平，以ELISA法检测脊髓组织中TNF-α、IL-6的表达水平；以TUNEL法检测各组大鼠损伤脊髓中细胞凋亡情况。
　　结果：
　　1.测序结果显示合成的shRNA片段与目标序列一致。
　　2.SCI后1d，可观察到Ad-GFP组和Ad-shIL-1β组受损脊髓组织中绿色荧光蛋白呈阳性表达；Ad-shIL-1β组大鼠的运动功能评分在SCI后7d、14d和21d均高于Vehicle组、Ad-GFP组，差异有统计学意义（P＜0.05）；SCI后21d，Ad-shIL-1β组的NeuN阳性细胞数比Vehicle组和Ad-GFP组明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；SCI后1d，Vehicle组、Ad-GFP组和Ad-shIL-1β组的IL-1β表达水平明显高于Sham组，Ad-shIL-1β组的IL-1β表达水平明显低于Vehicle组和Ad-GFP组，差异有统计学意义（P＜0.05）；SCI后1d，Vehicle组、Ad-GFP组和Ad-shIL-1β组TNF-α和IL-6水平明显高于Sham组，Ad-shIL-1β组的TNF-α和IL-6表达水平比Vehicle组和Ad-GFP组较低，差异有统计学意义（P＜0.05）；SCI后1d，Sham组与Vehicle组、Ad-GFP组和Ad-shIL-1β组相比，Bax和裂解caspase-3表达明显降低，Bcl-2表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05），Ad-shIL-1β组与Vehicle组和Ad-GFP组相比，Bax和裂解caspase-3表达明显降低，Bcl-2表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；Vehicle组、Ad-GFP组和Ad-shIL-1β组AI水平高于Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05），Ad-shIL-1β组的AI水平较Vehicle组和Ad-GFP组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.大鼠IL-1β shRNA腺病毒载体构建成功，能有效下调IL1-β的表达。
　　2.IL-1β表达水平降低能促进大鼠SCI后神经元的存活和运动功能的恢复，对SCI有保护作用。
　　3.IL-1β表达水平降低能通过抗炎作用而对脊髓起保护作用
　　4.IL-1β表达水平降低能降低损伤脊髓的细胞凋亡而对脊髓起保护作用。国家自然科学基金：编号81201403

目录

声明

前言

第一部分 大鼠IL1-βshRNA腺病毒的构建

一 材料与方法

二 结果

三 讨论

四 小结

第二部分 腺病毒介导的IL-1β基因沉默对大鼠脊髓损伤的保护作用及机制

一 材料与方法

二 结果

三 讨论

四 小结

局限性

全文总结

利益冲突

参考文献

综述:脊髓损伤的治疗研究进展

致谢