腺病毒介导OX40Ig基因转移在诱导大鼠肝脏移植物长期存活中的作用和机制研究

摘要

目的: (1)改良二袖套法大鼠原位肝脏移植动物模型的成功建立。 (2)改良二袖套法大鼠原位肝脏移植急性排斥动物模型的建立。 (3)重组腺病毒pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-OX40Ig(AdOX40Ig)的构建 (4)研究重组腺病毒AdOX40Ig不同感染剂量对人肝细胞HL-7702生长的影响及其感染效率，筛选最佳感染剂量进行该重组腺病毒的生物学功能研究。 (5)探讨腺病毒介导OX40Ig基因转移在诱导大鼠肝脏移植物长期存活中的作用和机制。 方法: (1)通过改良的双袖套法对130对SD大鼠进行了原位肝移植。前面40对为预试验组，中间60对为实验熟练组，后面30对为实验完善组。观察各组的手术成功率和术后生存率以及手术并发症。 (2)采用改良二袖套法行Lewis大鼠到Brown Norway(BN)大鼠原位肝脏移植共30例，将其随机分成实验组15例，术后未进行特殊的干预，和对照组15例，术后1～7天用FK5060.2mg/(kg.d)灌胃。术后4、7和10天的时间点上各组均随机处死3只受体大鼠，收集血清与肝脏标本，其余受体大鼠的血清标本通过舌静脉取血获得。血清标本检测细胞因子和生化指标，肝脏标本观察病理变化和肝细胞凋亡。每组各留6只观察术后生存情况及生存时间。 (3)将经过双酶切的hOX40片段和hIgG1 Fc片段与同样经过双酶切的pAdTrack-CMV载体进行连接反应，并在大肠杆菌感受态细胞里转化成pAdTrack-CMV-hOX40Ig转移质粒，再通过PCR扩增双酶切及DNA测序鉴定，经鉴定正确的质粒命名为pAdTrack-CMV-OX40Ig(pTOX40Ig)。 将pTOX40Ig转移质粒经Pme I单酶切线性化后，与pAdeasy-1腺病毒载体氯化钙法共转化BJ5183感受态细胞，涂布卡那平板，挑选克隆、扩增，抽提质粒行PER及Pac I酶切鉴定。 鉴定正确的重组腺病毒质粒pAdOX40Ig经Pac I酶切后，采用Lipofectamine2000脂质体转染法转染293A细胞，转染第3天在荧光显微镜下观察荧光。重组腺病毒AdOX40Ig通过Western印迹鉴定。 (4)将AdvOX40Ig重组腺病毒以1、10、25、50、100、200MOI不同剂量感染HL-7702细胞。在普通光镜视野下观察被感染后HL-7702细胞形态，在荧光视野下观察绿色荧光。 将AdvOX40Ig重组腺病毒和Ad空载体腺病毒以50MOI剂量分别感染爬片的HL-7702细胞，用免疫荧光染色试剂盒进行间接免疫荧光检测腺病毒介导的外源性OX40Ig基因在HL-7702细胞中的表达；用ELISA法测定转染AdvOX40Ig的HL-7702肝细胞培养上清。 (5)改良二袖套法行Lewis大鼠到Brown Norway(BN)大鼠原位肝脏移植40例，随机分成4组，每组10对。对照组：供、受体均未经任何处理，空载病毒AdEGFP处理组：术中供肝离体后肝内留存2ml的AdEGFP腺病毒[1×109pfu/ml]，AdOX40Ig处理组：术中供肝离体后肝内留存2ml的AdOX40Ig腺病毒[1×109pfu/ml]，FK506处理组：术后FK506(0.2mg·kg-1·d-1)灌胃。 术后第7天每组各处死BN鼠3只，先经下腔静脉抽血，取部分血清，进行肝功能的检测，取肝脏，观察病理变化和肝细胞凋亡，取脾脏细胞与Lewis大鼠和第三品系F344大鼠的脾脏细胞进行单向混合淋巴细胞反应(MLR)。在BN大鼠与Lewis大鼠的MLR反应体系中，另取3个复孔，在每个复孔中加入20μl(1 IU/μl)重组IL-2。取四组处死BN大鼠的剩余血清及术前舌静脉采血取得的血清，采用双抗体夹心ABE-ELISA法来检测IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的含量。余大鼠观察生存期，并且分别于病毒给予当天和第1、3、7、10、14、21和28天取大鼠尾静脉血，收集血清。用ELISA法检测血清中OX40Ig蛋白表达水平。结果 (1)预试验组的手术成功率和7天生存率分别为27.5％和0；实验熟练组分别为75.0％和40.0％；实验完善组分别为93.3％和86.7％。 (2)手术的成功率是93.7％(30/32)。实验组大鼠在术后7～10天表现出明显的急性排斥症状。实验组的生存时间是9.17±1.17(天)，而对照组是50.17±8.50(天)。实验组的肝功能(AST、ALT、TB)明显高于对照组。实验组术后第7天的血清IFN-γ和IL-2浓度明显高于术前，而IL-4和IL-10浓度则明显低于术前；对照组正好与此相反，术后第7天的血清IFN-γ和IL-2浓度明显低于术前，而IL-4和IL-10浓度明显高于术前。受体大鼠术后肝脏病理组织学检查发现，实验组术后第7天出现中度细胞性排斥，10天出现重度细胞性排斥，而对照组术后第7和第10天呈轻微细胞性排斥。此外，实验组肝细胞凋亡数较对照组显著增多。 (3)经酶切反应及DNA测序鉴定，重组腺病毒质粒pAdOX40Ig序列正确。重组腺病毒质粒pAdOX401g转染293A细胞，转染第3天在荧光显微镜下能观察到荧光。反复冻融的重组病毒子经多轮感染后，检测效价达到1010pfu/ml。重组腺病毒AdOX40Ig的Western印迹鉴定可以看到48.7kD的条带。 (4)在普通光镜视野下观察1、10、25、50、100MOI不同剂量重组腺病毒感染组HL-7702细胞均形态正常，生长良好；而200MOI剂量感染组细胞圆缩、脱落，呈现明显的细胞毒性；在荧光视野下，10、25、50、100、200MOI不同剂量重组腺病毒感染组HL-7702细胞几乎所有细胞均可观察到绿色荧光。 AdvOX40Ig感染组HL-7702细胞能检测到Cy3红色荧光，而Ad空病毒感染组和未感染组HL-7702细胞则未出现红色荧光。ELISA测定显示，AdOX40Ig感染组细胞培养上清中OX40Ig浓度明显高于无病毒感染组和AdEGFP感染组。 (5)AdOX40Ig处理组和FK506处理组受体大鼠存活时间明显超过对照组和空载病毒AdEGFP处理组，肝功能(AST、ALT、TB)明显低于对照组和空载病毒AdEGFP处理组，肝细胞性排斥明显低于对照组和空载病毒AdEGFP处理组，肝细胞凋亡也明显少于对照组和空载病毒AdEGFP处理组。术后AdOX40Ig处理组和FK506处理组受体大鼠血清中IFN-γ、IL-2的含量较术前明显降低，而IL-4和IL-10的含量则较术前明显升高；对照组和空载病毒AdEGFP处理组大鼠肝移植术后排斥组血清中IFN-γ、IL-2的含量较术前明显升高，而IL-4和IL-10的含量较术前明显降低。AdOX40Ig处理组和FK506处理组的CPM值均明显高于对照组和空载病毒AdEGFP处理组。在BN大鼠与Lewis大鼠的MLR反应体系中，加入重组IL-2，Ad0X40Ig处理组和FK506处理组CPM值下降轻，与未加入重组IL-2的CPM值相比，差异有统计学意义。在BN大鼠与F344大鼠的MLR反应体系中，CPM值结果显示对照组、空载病毒AdEGFP处理组和Ad0X40Ig处理组相互之间无统计学意义上的差异，但是这三组的CPM值均明显高于FK506处理组。 结论: (1)熟练和完善的外科操作技术是手术成功的关键；缩短无肝期时间是术后长期生存的有效保障。 (2)以近交系Lewis大鼠为供体、BN大鼠为受体的组合发生的急性排斥反应强烈而且稳定，是理想的大鼠肝脏移植急性排斥模型。 (3)重组腺病毒pAdOX40Ig构建成功，检测效价达到1010pfu/ml。 (4)结果表明10、25、50、100MOI不同剂量病毒感染HL-7702细胞对细胞几乎无毒性，而且呈很高的感染效率，其可达90％以上，这提示10MOI为最佳感染剂量。间接免疫荧光检测结果和ELISA法测定结果均表明，腺病毒介导的外源性OX40基因能在HL-7702细胞中成功表达。 (5)用OX40Ig处理供肝具有FK506的抗急性排斥反应的功能，具体表现在，用AdOX40Ig处理的大鼠存活时间长，肝细胞性排斥轻，肝细胞凋亡少，肝功能损害轻，免疫反应向Th2细胞偏移，被抑制的混合淋巴细胞反应能够被IL-2逆转。用AdOX40Ig处理供肝，能够抑制用同品系大鼠的刺激细胞引起的混合淋巴细胞反应，但不能抑制用异品系大鼠的刺激细胞引起的混合淋巴细胞反应，这与FK506不同。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

序言

第一部分 改良二袖套法大鼠原位肝脏移植动物模型的建立

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨 论

五、结论

六、参考文献

第二部分 改良二袖套法大鼠原位肝脏移植急性排斥动物模型的建立

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结 论

六、参考文献

第三部分 重组腺病毒载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-OX40Ig(AdOX40Ig)的构建

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨 论

五、结 论

六、参考文献

第四部分 重组腺病毒AdOX40Ig的体外试验

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

六、参考文献

第五部分腺病毒介导OX40Ig基因转移在诱导大鼠原位肝脏移植物长期存活中的研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

六、参考文献

综述1：肝脏移植免疫抑制治疗现状

综述2：OX40／OX40L信号通路在免疫应答中的作用

攻读学位期间公开发表的论文、参编著作

致谢