ADAMTS13蛋白C-末端结构域及TSP1调节ADAMTS13酶活性的研究

摘要

ADAMTS13，又名血管性血友病因子裂解蛋白酶，其主要功能是特异性裂解血管性血友病因子(VWF)，从而调节抑制VWF介导的血小板血栓形成。2001年人ADAMTS13的基因首次被克隆报道，并定位于9号染色体长臂端(9q34)，基因全长37kb，主要由29个外显子组成，其基因表达开放阅读框为4284bp，编码1427个氨基酸。ADAMTS13蛋白主要由9个结构功能域组成，具体分别包括：信号肽、前导肽、金属蛋白酶结构域、去整合素结构域、凝血酶敏感蛋白1(TSP1)第1基序、富半胱氨酸区域、间隔区、凝血酶敏感蛋白1(TSP1)第2-8重复基序、补体结合区域(CUB)，其中信号肽和前导肽在成熟ADAMTS13蛋白细胞分泌前被切掉。目前研究证实，ADAMTS13酶活性严重降低可以导致血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的发病，不仅在TTP中，近年来在大多数血栓性倾向的疾病当中均检测到ADAMTS13酶活性的不同程度缺失，ADAMTS13基因的缺陷或其自身抗体的存在是已知的可以导致酶功能活性严重缺失的主要病理因素，那么是否还有其他因素可以造成ADAMTS13酶活性的减少，最终导致血浆VWF降解程度的受损?对于ADAMTS13蛋白功能基础调节的研究一直是血栓性疾病领域的研究热点之一。我们在前期相关工作的基础之上，进一步深入研究分析了ADAMTS13酶活性的一些调节因素，以及初步探讨了ADAMTS13与微血管内皮细胞之间的相互关系，同时建立了一种新型的ADAMTS13的酶活性检测方法。
　　 一、ADAMTS13蛋白C-末端结构域调节自身酶活性的研究
　　 目前研究表明，ADAMTS13在酶切底物VWF的过程中存在着广泛的相互结合，金属蛋白酶结构域是ADAMTS13蛋白酶活性发挥的关键中心，而去整合素结构域、凝血酶敏感蛋白1(TSP1)第1基序、富半胱氨酸区域、间隔区这些结构域对于静态条件下ADAMTS13酶活性的发挥有着重要的影响，尤其是间隔区，目前已经证实在多数获得性TTP患者当中均检测到间隔区位点自身抗体的存在。ADAMTS13蛋白C-末端结构域被认为对于其酶活性的贡献较小，然而C-末端CUB区域却是ADAMTS13在该家族中所具有的特有性结构域，近年来，有研究提示重组表达的ADAMTS13 C-末端蛋白多肽在高剪切力条件下可以竞争性抑制ADAMTS13酶活性，而且C-末端的TSP1重复基序与CUB区可能共同对于ADAMTS13酶活性的发挥起重要作用。因此，我们对于ADAMTS13蛋白C-末端结构域功能进行了初步的研究。
　　 首先，我们利用含人ADAMTS13全长及去C-末端TSP8+CUB区截短型基因序列质粒pSecTag-ADAMTS13-His，经脂质体介导真核转染Hela细胞，经潮霉素筛选获得稳定表达rADAMTS13的两株细胞株，收集无血清培养上清，浓缩后上清经过Ni-NTA Agarose柱子进行纯化，之后经分光光度计测定OD280计算蛋白浓度以及Westerblot鉴定。结果表明：我们获得了全长野生型及C-末端截短型rADAMTS13蛋白，初步OD280计算蛋白浓度(野生型及截短型rADAMTS13蛋白分别为116ug/ml，126ug/ml)，Westerblot结果也证实其特异性，重组表达的蛋白分子大小与预期基本一致。
　　 其次，我们以纯化的血浆VWF蛋白作为检测底物，分别在静态或动态涡流条件下，利用R-CBA法以及Reduced-SDS-PAGE法检测了这两种rADAMTS13蛋白的酶活性，同时利用ELISA方法检测了这两种rADAMTS13蛋白与VWF底物的结合能力。结果表明：在静态尿素变性条件下，Reduced-SDS-PAGE法检测酶切后获得的VWF176KD的特异性裂解片段来反应酶活性的大小，发现野生型及截短型rADAMTS13蛋白均能对VWF进行切割，但去C-末端的截短型rADAMTS13蛋白酶活性较野生型有所增强，R-CBA法定量检测酶活性提示，野生型及截短型rADAMTS13蛋白的平均活性为61.23±7.67％、92.84±0.38％。二者之间有显著差异(p<0.01)；ELISA法检测分析静态条件下rADAMTS13与包被在96孔板上的VWF结合能力，发现无论是野生型还是截短型rADAMTS13蛋白，结合VWF的能力均随着蛋白浓度的增高而增强，但截短型rADAMTS13蛋白结合VWF的能力明显高于野生型；然而在高剪切力条件下，仅全长野生型rADAMTS13蛋白能对VWF进行切割，但酶切能力较静态条件下有所减弱，平均活性为41.34±18.06％，截短型rADAMTS13蛋白在高剪切力条件下几乎检测不到活性，活性低于5％。
　　 二、TSP1调节ADAMTS13酶活性的研究
　　 血小板敏感蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP1)，同VWF一样，也储存于血小板α-颗粒，有研究发现，TSP1可以保护血管内皮细胞表面VWF介导的血小板血栓形成，并推测认为TSP1很可能是通过与vWFA3区的有效结合，从而竞争抑制了ADAMTS13酶活性的发挥。而ADAMTS13与VWFA区均存在着广泛的结合，尤其是VWFA2区，考虑本实验室初期已经制备表达了VWFA1、A3区蛋白，我们进一步构建表达了VWFA2区蛋白，并对TSP1调节ADAMTS13酶活性具体机制做初步的分析。
　　 首先，我们以含人vWF全长cDNA序列质粒pSVvWF为模板，采用A2区特异性引物进行PCR扩增，直接扩增获得VWFA2区基因片段，并用T4 DNA连接酶连接构建了pUCm-T-VWFA2重组质粒，之后双酶切鉴定及测序分析，结果均表明克隆的A2区基因片段是完全正确的，于是我们再次成功连接构建了PQE30-VWFA2重组表达质粒，利用该表达质粒在M15表达菌中进行了诱导表达，经Ni-NTA Agarose柱子对诱导表达蛋白进行了纯化，纯化后电泳并经考马斯亮蓝染色鉴定，可见约25 kD单一的蛋白条带，分子量与我们预期表达的VWFA2区蛋白分子量相一致。结果证明我们获得了纯度很高的VWFA2区原核表达蛋白，这为进一步研究其ADAMTS13酶蛋白的生物学功能奠定了基础。
　　 其次，我们分别以纯化的血浆全长VWF蛋白、VWFA1、A2、A3区为检测底物，R-CBA以及Westerblot分析观察TSP1直接对ADAMTS13酶切血浆全长VWF蛋白、A2区的影响，ELISA观察TSP1直接对ADAMTS13结合血浆全长VWF蛋白、各A区蛋白的影响。结果提示：在生理最大TSP1浓度条件下，其可以显著抑制ADAMTS13与VWF的相互结合；TSP1直接抑制ADAMTS13对VWF的裂解，最大抑制率可达70％；ADAMTS13与TSP1在VWF A2和A3区存在竞争性结合位点，TSP1可以直接抑制ADAMST13对VWFA2区蛋白的裂解。
　　 三、ADAMTS13与微血管内皮细胞关系的研究
　　 同肝脏星状细胞一样，血管内皮细胞也是血浆ADAMTS13产生的主要来源，这一点已经得到国外研究的证实在，但这些研究都集中的一些大血管内皮细胞中，而对于微血管细胞中ADAMTS13的表达研究较少；ADAMTS13调节VWF介导的血小板血栓形成过程又主要发生在微血管内皮细胞表面，那么对于微血管内皮细胞本身是否参与其局部血管周围ADAMTS13酶活性的改变呢?另外，有报道提示ATRA可以通过下调细胞内组织因子(TF)的表达，以及促进其血栓调节蛋白(TM)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)等基因的表达，从而改善血管内皮细胞的高凝状态，那么ATRA对于微血管内皮细胞表达分泌ADAMTS13与VWF平衡是否也存在影响?因此，我们带着这些问题对ADAMTS13与微血管内皮细胞关系做了初步的研究。
　　 首先，我们分别运用流式细胞技术和免疫荧光显微镜直接检测观察了微血管内皮细胞株IIMEC-1中ADAMTS13表达情况，同时我们也利用免疫荧光显微镜检测观察了HMEC-1中VWF的表达分布情况，发现在微血管内皮细胞株中的确存在大量ADAMTS13表达，并且内皮细胞中ADAMTS13与VWF表达的分布有部分相同叠加区域，这一点与国外研究者在一些大血管内皮细胞株中报道的情况相一致；我们也运用流式细胞技术初步检测观察了重组ADAMTS13蛋白与微血管内皮细胞株HMEC-1膜表面相互作用，我们的检测结果提示ADAMTS13可以与微血管内皮细胞膜表面相结合，这种结合可能并不依赖于ADAMTS13的C末端，并且这种结合可以被TSP1蛋白所阻断。
　　 其次，我们分别利用实时定量PCR以及Westerblot技术，在基因和蛋白水平证实了ATRA可以上调微血管内皮细胞中ADAMTS13的表达，从而增加分泌上清中ADAMTS13的酶活性。同时，我们也进一步证实了部分炎性因子如TNF-α可以抑制血管内皮细胞ADAMTS13的表达，这与国外报道基本一致。我们的结果也表明，ATRA同样可以逆转TNF-α对ADAMTS13表达的抑制效应，而ATRA对于HMEC-1中VWF的分泌并无影响。因此，我们认为ATRA可以通过有效改善血管内皮细胞表达分泌ADAMTS13与VWF平衡的影响，从而改善机体的高凝状态。
　　 四、一种新型ADAMTS13酶活性检测方法的建立及其评价
　　 ADAMTS13酶活性的检测不仅仅对于TTP的临床诊断有重要价值，而且可能对于TTP的预后评估也有指导意义。然而目前现有的一些检测方法均存在不同程度的缺陷，无法推广，鉴于此，继续研究开发新型ADAMTS13酶活性检测方法仍然是有必要的。我们利用我所特有的两株新开发的VWF单克隆抗体--分别是针对VWFA1及A3区的单抗SZ129、SZ125，以血浆自身的VWF作为底物，建立了一种新型的ADAMTS13酶活性检测方法，并对其进行了初步的评价和临床应用。我们的结果表明：我们建立了一种新型的ADAMTS13酶活性检测方法，该方法简便易行，检测结果准确，可重复性较好，适合于普通临床推广及实验室应用。