人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)辅助蛋白ns12.9的生理功能和分子机制研究

摘要

冠状病毒(CoVs)是具有包膜的，单股正链RNA病毒。冠状病毒在自然界中分布广泛，在人、哺乳类和鸟类中都存在，通常造成呼吸道和胃肠道的感染疾病，但某些物种的冠状病毒也能够导致肝脏或神经系统感染，由此可知冠状病毒是一种在临床医学和兽医学中都应受到重视的致病病毒。虽然人类冠状病毒早在十九世纪六十年代就已被发现，但是直到2003年高致病性SARS冠状病毒(SARS-CoV)的全球大流行，人类冠状病毒的研究才受到广泛关注和重视。冠状病毒基因组除了编码结构蛋白外（如replicase、S、E、M和N），在其结构基因之间还穿插着一系列的辅助蛋白基因。冠状病毒辅助蛋白具有病毒毒株特异性，其辅助蛋白基因个数从最少的一个(HCoV-NL63)到最多的八个(SARS-CoV)。有趣的是，有且只有一个辅助蛋白基因是在所有冠状病毒中都存在的，那就是在S与E基因之间的辅助蛋白基因，我们称之为SNE基因。考虑到SNE基因的这一特异性，我们推测其在冠状病毒感染过程中可能发挥着重要的、保守的功能。我们实验室之前的工作发现了SARS-CoV的SNE蛋白3a具有病毒离子通道的功能，并通过某种未知的机制来调控病毒的增殖。
　　病毒离子通道蛋白是一类病毒编码的小分子疏水性蛋白。目前已发现在多种RNA病毒和DNA病毒中都能编码表达，如甲型流感病毒的M2蛋白、人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的Vpu蛋白和JC多瘤病毒的agnoprotein蛋白等。病毒离子通道蛋白具有一些分子共性，包括膜定位、同源寡聚化和离子通道活性等。病毒离子通道蛋白插入到宿主细胞膜上会形成亲水性孔道，介导一些离子或者小分子通过，改变细胞的生理稳态，从而有助于病毒感染生活周期的多个阶段的有利进行。考虑到病毒离子通道蛋白对病毒感染的重要性，病毒离子通道蛋白无疑是一个非常有应用前景的抗病毒治疗靶点。目前，已有公司开发出一些针对病毒离子通道蛋白的离子通道抑制剂作为抗病毒药物，并进入了临床试验。此外，基于病毒离子通道蛋白缺失突变病毒来开发减毒疫苗也是一个非常有前景的选择。
　　人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)是在上世纪60年代从一位普通感染病人中分离出来的。除了是普通感冒的主要病原体之一，HCoV-OC43感染免疫低下病人或老人时会引发肺炎甚至死亡，这也说明了HCoV-OC43病毒感染致病机理研究的重要性。通过对病毒基因组碱基序列分析发现，HCoV-OC43的SNE基因编码了一个分子量为12.9 kDa的小分子蛋白，并命名为ns12.9。但是有关ns12.9蛋白在HCoV-OC43病毒感染过程中是否发挥作用还是未知的。在本课题研究中，我们通过反向遗传学系统构建了ns12.9蛋白缺失的突变病毒HCoV-OC43-Δns12.9来探究在病毒感染时ns12.9蛋白的功能。利用电生理平台，我们发现ns12.9蛋白能够在细胞膜上发生同源寡聚化形成离子通道，说明了ns12.9蛋白同SARS-3a蛋白一样，是一种新发现的病毒离子通道蛋白。突变病毒HCoV-OC43-Δns12.9在体外细胞中和小鼠体内都表现出增殖缺陷，相比于野生型病毒HCoV-OC43-WT，其病毒滴度下降了至少10倍，这一现象证实了病毒离子通道蛋白ns12.9在HCoV-OC43病毒感染时发挥着非常重要的作用，参与感染性病毒粒子的产生。
　　通过对病毒感染的单个生活周期的系统性分析，我们发现病毒离子通道蛋白ns12.9对HCoV-OC43病毒感染的侵入、基因组复制、亚基因组信使RNA（sgmRNAs）的合成以及蛋白合成阶段都没有任何影响，暗示着病毒离子通道蛋白ns12.9可能在HCoV-OC43病毒感染的后期阶段发挥作用。随后通过透射电子显微镜成像实验，我们发现突变病毒HCoV-OC43-Δns12.9在胞内病毒组装过程中受到抑制。相比于野生型病毒HCoV-OC43-WT，突变病毒HCoV-OC43-Δns12.9胞内的病毒粒子数显著减少，并表现出一种中空的畸形形态，说明了病毒离子通道蛋白ns12.9参与了HCoV-OC43病毒粒子的形态发生。此外，小鼠在感染突变病毒HCoV-OC43-Δns12.9后的体重下降程度、炎症反应、病毒载量和死亡率都显著减弱，说明了病毒离子通道蛋白ns12.9与HCoV-OC43病毒的毒力相关。重要的是，通过体外瞬时补偿试验，其他人类冠状病毒的SNE蛋白和其他病毒离子通道蛋白能够补偿突变病毒HCoV-OC43-Δns12.9的体外增殖缺陷，证实了人类冠状病毒的SNE蛋白在冠状病毒感染组装过程中发挥着重要的、保守的功能，而且这种功能的发挥是由其离子通道活性所介导的。
　　综上所述，我们的研究详细解析了ns12.9辅助蛋白在HCoV-OC43病毒感染过程中的生理功能和分子机制，为深入理解冠状病毒的感染生活周期和致病机理做出了重大贡献，为开发高效抗病毒药物和减毒疫苗来治疗或预防冠状病毒感染提供了坚实的理论基础和实验依据。

目录

声明

摘要

1、引言

2、实验材料和方法

2．1 细胞与病毒

2．2 病毒感染

2．3 质粒构建

2．4 抗体和试剂

2．5 细胞质粒转染

2．6 聚合酶链式反应(PCR)

2．7 免疫荧光染色

2．8 免疫印迹(Western blot)

2．9 免疫共沉淀(Co-IP)

2．10 流式细胞术检测(FACS)

2．11 电生理检测

2．12 酵母钾离子互补实验

2．13 体外拯救重组HCoV-OC43病毒

2．14 免疫过氧化物酶试验(IPA)滴定病毒滴度

2．15 病毒生长曲线

2．16 RNA提取和反转录

2．17 荧光实时定量PCR(qRT-PCR)

2．18 透射电子显微镜(TEM)

2．19 病毒体内(小鼠)感染实验

2．20 酶联免疫吸附试验(ELISA)

2．21 数据统计分析

3、实验结果

3．1 HCoV-OC43辅助蛋白ns12．9是病毒离子通道蛋白

3．2 ns12．9基因缺失的cDNA克隆pBAC-OC43-△ns12．9的构建

3．3 体外拯救突变病毒HCoV-OC43-△ns12．9

3．4 突变病毒HCoV-OC43-△ns12．9在体外感染增殖能力减弱

3．5 体外瞬时表达ns12．9蛋白能够补偿突变病毒HCoV-OC43-△ns12．9产量

3．6 病毒离子通道蛋白ns12．9不影响HCoV-OC43病毒的侵入，基因组复制，sgmRNAs合成和蛋白表达

3．7 病毒离子通道蛋白ns12．9影响HCoV-OC43病毒的组装

3．8 突变病毒HCoV-OC43-△ns12．9在体内感染增殖能力减弱

3．9 体外瞬时表达其他人类冠状病毒的SNE蛋白能够补偿突变病毒HCoV-OC43-△ns12．9产量

3．10 体外瞬时表达其他病毒的离子通道蛋白能够补偿突变病毒HCoV-OC43-△ns12．9产量

4、结论和讨论

参考文献

专业综述 病毒离子通道蛋白研究进展及前景

攻读学位期间发表的学术论文

附录

致谢