CHD1基因在急性髓细胞白血病中的表达特征及临床意义

摘要

本论文包括两部分：（一）CHD1基因在急性髓细胞白血病中的表达特点及意义；（二）CHD1-RUNX1融合基因的致病机制研究。
　　第一部分：CHD1基因在急性髓细胞白血病中的表达特点及意义
　　目的：
　　检测本中心初诊急性髓细胞白血病（AML）患者 CHD1基因的表达水平，探讨CHD1基因的表达情况与初诊AML患者的FAB分型、染色体核型、基因突变等实验室检查及预后的相关性。
　　方法：
　　1.收集188例初诊AML患者骨髓标本、30例非恶性血液病患者骨髓标本，采用实时定量PCR方法检测其CHD1基因的表达水平，并进行GAPDH内参基因表达的测定，CHD1基因相对表达量=2-(CT0f gene-CT of internal control)，通过cutoff finder网站确定0.038作为临界值，因此规定低于0.0038为CHD1基因低表达，高于0.0038为CHD1基因高表达。
　　2.应用相关统计学方法分析 CHD1基因的表达与 FAB分型、染色体核型、基因突变等的相关性。对164例non-M3 AML患者进行随访，分析初诊non-M3 AML患者CHD1基因的表达水平与OS及EFS的关系，探讨CHD1基因表达水平的高低与疾病危险度及预后的相关性。
　　结果：
　　1.不同CHD1基因的表达水平在188例初诊AML患者中均检测到，其中CHD1基因低表达者占134/188（71.3％）。在FAB分型（M1到M6）中，均出现CHD1基因的低表达，其中在M2亚型中所占比例最高（28.4%），其次为M1(23.1%), M4(17.2%), M5(12.7%), M3(11.2%), M6(7.5%)。M1到M6各亚型间差异未见统计学意义（P>0.05）。
　　2.188例初诊AML患者CHD1基因的表达水平相比于30例非恶性血液病患者（包括缺铁性贫血及原发免疫性血小板减少症）显著降低，差异具有显著统计学意义（P<0.0001）。在188例初诊AML患者中，CHD1基因低表达组与高表达组相比，具有较小的中位发病年龄（median,39 vs.44,P=0.047）及较低的血红蛋白计数（77 vs.99.5g/L, P=0.001）。而两组在性别、白细胞及血小板计数、乳酸脱氢酶水平及初诊骨髓原始细胞百分比方面相比，两组未见明显差异（P>0.05）。在149例患者中进行基因突变分析发现，CHD1低表达组中，CEBPA等位基因双突变的发生率较低（16.7%vs.31.7%,P=0.043）。在预后危险分层中，CHD1低表达组的患者预后中等及预后较差组所占比例显著增高（109/119,91.6%）。在164例non-M3 AML患者染色体核型分型中，CHD1低表达组复杂核型异常所占比例较高表达组显著增高，差异有统计学意义（P=0.029）。
　　3.在164例non-M3 AML患者中进行完全缓解率及复发率比较，可以看出，在CR率的比较中，CHD1低表达组显著低于CHD1高表达组（57.1% vs.75.6%, P=0.030）。而相对于复发率，CHD1低表达组复发率有增高趋势，但未出现统计学差异（14.7% vs.23.5%,P=0.299）。164例non-M3 AML患者生存分析显示，OS及EFS在CHD1低表达组显著偏低（P=0.024, P=0.032）。在单用化疗的68例患者中根据cutoff值分为CHD1低表达及高表达两亚组，其中，CHD1低表达组中OS及EFS显著偏低，达统计学差异（P=0.047, P=0.040）。另外，在90例正常核型亚组分析中，EFS在CHD1低表达组同样也是显著降低的（P=0.023），但两组OS差异无统计学意义（P=0.069）。多因素分析显示，CHD1基因的低表达水平对 OS具有独立预后意义（HR=4.579;95%CI,2.169-9.664,P=0.000）。
　　结论：
　　CHD1基因作为抑癌基因，与非恶性血液病患者相比，初诊AML患者CHD1基因的表达水平显著降低。该基因的表达水平与实验室特征、疾病危险分层及患者预后等临床特征相关。CHD1基因的表达水平可作为初诊AML患者的预后分层指标之一。
　　第二部分：CHD1-RUNX1融合基因的致病机制研究
　　目的：
　　探讨重组腺病毒介导的CHD1-RUNX1融合基因对小鼠NIH3T3成纤维细胞增殖和凋亡能力的影响。
　　方法：
　　1.将携带CHD1-RUNX1融合基因的重组质粒载体pHBAd-MCMV-REP转染小鼠NIH3T3细胞系，构建稳定表达CHD1-RUNX1蛋白的细胞株，同时设立空载体转染组及空细胞对照组。
　　2.确定重组腺病毒Ad-CHD1-RUNX1在NIH3T3细胞中的感染效率，最佳感染时间和MOI值，并采用RT-PCR方法检测转染后CHD1-RUNX1在NIH3T3细胞中的表达情况。
　　3.通过 CCK8实验观察转染后 NIH3T3细胞的增殖能力，以及流式细胞术（Annexin V/7-AAD）检测转染后NIH3T3细胞的凋亡情况。
　　结果：
　　1.重组腺病毒Ad-CHD1-RUNX1转染NIH3T3细胞MOI值为150，转染时间在48h时，倒置荧光显微镜观察NIH3T3细胞的感染效率最高，约为70%。通过实时定量RT-PCR方法检测到转染后NIH3T3细胞CHD1-RUNX1的表达。该融合基因的成功转染为下一步研究该重组腺病毒对NIH3T3细胞的生物学效应奠定了基础。
　　2.实验组NIH3T3细胞体外增殖能力与空载体对照组相比显著增强（P<0.05）。并随转染时间的延长，实验组NIH3T3细胞的增殖能力逐渐增强。在转染24h后，细胞生长速度明显加快，到48h达高峰。流式细胞检测细胞凋亡实验可发现， CHD1-RUNX1融合基因可抑制小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的凋亡。
　　结论：
　　此细胞功能学实验证实了重组腺病毒 Ad-CHD1-RUNX1转染 NIH3T3细胞后可促进其体外增殖能力，并可以抑制其凋亡。这一实验结果初步阐明了CHD1-RUNX1融合基因的生物学行为，为后续进一步研究该融合基因对白血病细胞生物学特性的影响，以及致白血病机制提供了实验基础。

目录

声明

第一部分 CHD1在急性髓细胞白血病中的表达特点及临床意义

1.1 引 言

1.2材料和方法

1.3 结 果

1.4 讨 论

参考文献

第二部分 CHD1-RUNX1融合基因的致病机制研究

2.1 引 言

2.2 材料和方法

2.3 结 果

2.4 讨 论

参考文献

总结

综述:CHD蛋白家族的结构与功能研究

中英文缩略词汇表

攻读学位期间公开发表的文章

致谢