非洲爪蟾APRIL及犬LIGHT、HVEM的克隆、表达及生物学活性研究

摘要

本论文共分为两个大部分:
　　第一部分非洲爪蟾增殖诱导配体APRIL的相关研究。本研究通过RT-PCR和RACE技术成功克隆了非洲爪蟾的增殖诱导配体（XIAPRIL）基因的全长序列，并进行了结构及功能上的鉴定。全长一共1504bp，其中包括91bp的5'端非编码区、714bp的3'端非编码区和699bp的开放阅读框（编码232个氨基酸）。通过序列比对发现，非洲爪蟾的APRIL含有两个保守的半胱氨酸残基（Cys178 and Cys193）、弗林酶切位点和TNF典型结构域。Blast分析表明，跟已知物种的APRIL序列比对，胞外段的同源性比全长的同源性高，说明受体结合区域的保守性更高。荧光定量PCR结果显示非洲爪蟾的增殖诱导配体在脾脏中高表达。通过采用与SUMO融合表达的方法，在Rosseta菌中通过Ni柱亲和层析制备到大量可溶重组APRIL蛋白，并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫转印检测(Western blotting)鉴定。体外WST-8测活实验结果显示非洲爪蟾APRIL对爪蟾淋巴细胞和小鼠的B细胞均具有促增殖/存活的作用。
　　第二部分犬LIGHT及其受体HVEM的相关研究。鉴于两者对于免疫调节的重要作用，本文选择犬作为研究对象，从犬的脾脏组织中通过RT-PCR的方法分别扩增得到开放阅读框为723bp的LIGHT基因和819bp的HVEM基因，并对这两个基因进行了一系列的生物信息学分析，结果表明犬LIGHT蛋白是典型的Ⅱ型跨膜蛋白，而HVEM蛋白为典型的Ⅰ型跨膜蛋白。组织定量分析发现LIGHT和HVEM的mRNA在很多的组织中都有表达，但是在脾脏中的相对表达量都是最高的。通过基因工程手段，分别构建了pET43.1 a-dsLIGHT和pET28a-dsHVEM重组载体，通过原核表达，金属亲和层析的方法在体外获得了相应的可溶性蛋白，并对其生物学功能进行了初步探索。通过激光共聚焦显示两个基因在T细胞表面的结合，通过软件模拟显示两个基因3D结构的结合。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 文献综述

第一章 增殖诱导配体(APRIL)的研究进展

1．1 APRIL的发现及结构特点

1．2 APRIL的受体及结构特征

1．3 APRIL及其受体的组织细胞分布

1．4 APRIL及其受体的信号转导途径

1．5 APRIL的生物学功能

1．6 展望

第二章 LIGHT及其受体HVEM的研究进展

2．1 LIGHT结构特点及表达分布

2．2 LIGHT受体的结构特点及表达分布

2．3 LIGHT及其受体的生物学作用

2．4 LIGHT与受体介导的信号通路

2．5 展望

第三章 研究物种简介

3．1 非洲爪蟾简介

3．2 非洲爪蟾的研究进展

3．3 犬简介

第二部分 实验部分

第四章 非洲爪蟾增殖诱导配体(APRIL)的克隆、表达及生物学功能研究

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果与分析

4．4 讨论

第五章 犬LIGHT和受体HVEM的克隆、表达及其生物学活性研究

5．1 实验材料

5．2 实验方法

5．3 实验结果与分析

5．4 讨论

全文总结

参考文献

附录：硕士在读期间研究成果

致谢