利用RNA干扰机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖

摘要

本文利用PCR方法扩增出了PRRSVVR2332resp株的核衣壳蛋白基因(N基因)，并克隆进荧光表达载体pEGFP-N1中，利用卡那抗性筛选得到重组阳性克隆，经双酶切鉴定成功后，命名为pEGFP-N1-ORF7。选定PRRSVVR2332resp株N基因两处靶位点，并且提交NCBI的BLAST系统证明其与其它物种的低同源性后，设计合成六条单链，两两退火后克隆入RNA干扰载体pBS/U61.0中，利用氨苄抗性筛选，并经缺失酶切位点XhoI鉴定，得到两个干扰载体pBS/U6-60和pBS/U6-260，以及一个对照载体pBS/U6-Neg.　　将真核表达荧光载体pEGFP-N1-ORF7分别与pBS/U6-60，pBS/U6-260以及对照载体pBS/U6-control共转染入293T细胞中，16小时后检测，通过GFP表达数量以及用Western-blot鉴定GFP具体表达量的对比，观察到pBS/U6-60，pBS/U6-260对pEGFP-N1-ORF7的表达有明显的抑制作用，并用RT-PCR确定表达产物为目的产物，证明本实验中干扰载体的高度特异性。结果可以看出，RNAi可以对PRRSVN基因的表达产生干扰作用，提出所选取的靶位点可能是两个对PRRSV全病毒复制起抑制作用的潜在位点。　　转染pEGFP-N1荧光载体进入MARC-145细胞系，摸索真核表达载体在MARC-145细胞中高效表达的条件。选取接毒后72小时，对病毒中N基因的表达情况进行Western-blot鉴定，结果显示，pBS/U6-60干扰PRRSVVR2332Resp株N基因表达的效率可以达到70.15﹪。 最终，(Ⅰ)证实在真核细胞水平上，可以利用RNA干扰机制抑制PRRSVVR2332resp株的增殖；(Ⅱ)提出在所选PRRSVVR2332resp株N基因的两处靶位点序列中，存在病毒复制的关键性作用位点的观点；(Ⅲ)为日后新型PRRSV疫苗设计打下一定的理论基础。

目录

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第一篇文献综述

第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展

1.病毒的生物学特性

2.病毒的基因组结构

3.病毒基因组的转录表达

4.病毒基因组所编码的蛋白

5.病毒结构蛋白的抗原性

6.PRRSV分离株的序列差异及遗传学变异性

7.结语

参考文献

第二章RNA干扰

2.1.RBAi与生物化学研究

2.2哺乳动物中的RBAi

参考文献

第二篇研究内容

第三章利用RNA干扰机制干扰猪繁殖与呼吸综合征N基因表达

摘要

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第四章利用RNA干扰机制抑制猪繁殖与呼吸综合征的增殖

摘要

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

致 谢