SARS病人组织中SARS冠状病毒全基因组克隆、序列分析及病毒样颗粒装配

摘要

2003年春季在我国广东、北京等地人群中爆发了以高热、寒战、肌肉痛、干咳、呼吸困难、高度接触性传染为主要特点的传染性疾病，随后该疾病被正式命名为“严重急性呼吸综合症(简称SARS)”。病因学研究表明，SARS的病因是一种新型冠状病毒，世界卫生组织将其命名为SARS相关冠状病毒(SARS-associatedcoronavirus，SARS-CoV)。作为一种新发现的病毒，目前对其遗传学和复制、装配机制等还所知甚少，因此开展此方面研究具有重要意义。 笔者参与了SARS病原的调查工作。为深入阐明北京地区流行的SARA-CoV的病原学特征，首先从SARS病人病料标本中进行病毒分离试验。将SARS病人临床标本，如咽拭子、痰液和肺组织标本接种Vero细胞，连续传代后，可观察到显著的细胞病理改变(CPE)，表明可能标本中可能存在病毒。电镜观察分离物培养上清负染样本，，可见到形态与典型冠状病毒外观相似的病毒样颗粒；用SARS病人康复期血清进行的间接免疫荧光试验，显示分离物接种培养的细胞胞浆内存在特异性荧光，证实培养物中存在与SARS-CoV相关的病毒抗原；提取分离物总RNA进行RT-PCR检测，可用冠状病毒基因组序列特异性引物扩增特异性片段，克隆扩增片段后进行DNA序列分析，结果显示所扩增的片段为冠状病毒保守的复制酶基因区序列。因此综合以上结果，提示分离到的病毒为SASR冠状病毒 为比较来源于SARS病人人体组织和已经分离、培养的SARS-CoV基因组之间的差异，阐明病毒的遗传和变异特点并深入探讨其致病机制，利用RT-PCR从北京地区一例SARS死亡病人(＃5)肺组织总RNA中对SARS-CoV组织毒的基因组全长cDNA进行了克隆和序列分析。参考已经发表的SARS-CoV全序列，将待测定的SARS-CoV全长基因组分成26个片段，设计引物进行扩增。扩增并克隆的26个目的片段覆盖SARS-CoV全长基因组。测序结果表明本次实验中SARS-CoV-5＃毒株基因组全长29707个核苷酸。同源性比对结果表明，SARS-CoV组织毒5＃基因组序列与BJ01-BJ04地方分离株为同一流行株型。本次试验测定的组织毒的基因组序列在基因组水平上与18株全序列已知人源毒株的碱基差异不明显，而与10株动物来源的SARS-CoV分离株全序列在92个核酸位点上存在明显差异，这说明人源SARS-CoV毒株的全序列与动物源SARS-CoV毒株的全序列存在基因组水平的破基差异，而细胞培养和人体组织来源的SARS毒株不存在基因组水平的碱基差异。对各种来源的SARS病毒的S蛋白质基因分析同样也显示了类似的碱基差异分布特点，即人源和动物源的SARS-CoVS基因存在多处实质性差异，而组织毒和培养毒株间的碱基差异不明显、由此推断SARS-CoV在病毒种属进化过程中，特别是在病毒宿主迁移过程中，发生多处实质性点突变以适应从动物到人体环境的宿主环境差异。 为了进一步研究SARS-CoV主要结构蛋白质在病毒复制中的功能，首先在昆虫细胞中对它们进行了表达，然后在昆虫细胞中进行SARS-CoV病毒样颗粒(viral-likeparticle，VLP)的体外装配试验。为提高上述结构蛋白质基因在昆虫细胞中的表达水平，提高VLP体外装配的效率，首先通过拼接PCR方法人正合成并克隆了密码子优化的SASR-CoV结构蛋白质基因E和M的完整阅读框Eop、Mop，测序结果表明合成基因符合预期设计。另外为便于检测，在Mop基因蛋白质编码区紧邻终止密码子前插入FLAG肽标签编码序列，获得Mop(F)基因。随后将经过密码子优化的SASR-CoV主要结构蛋白质基因Sop、Eop、Mop、Mop(F)及野生型Nwt基因，分别或依设计组合插入杆状病毒转座载体，通过细菌内转座实验获得一组包含上述目的基因或基因组合的重组杆状病毒Bacmid。将重组杆状病毒Bacmid转染Sf9昆虫细胞后，获得相应的重组杆状病毒。蛋白质质印迹法检测表明，获得的重组杆状病毒在Sf9细胞中可高效表达SARS-CoV的4种结构蛋白质S、M、E、N，表达产物抗原性和分子量符合预期。 将各种重组杆状病毒以不同的组合形式感染Sf9细胞，进行SARS-CoV病毒样颗粒(VLP)的体外组装试验。结果表明，M、E、S蛋白质在细胞内的同时表达，可在细胞浆内组装出形态学上与感染Vero细胞内SARS-CoV颗粒相似的结构；E、M蛋白质在昆虫细胞Sf9内同时表达时也可在胞浆内产生类似成熟病毒颗粒的结构。据报道M蛋白质C末端突变对该蛋白质在病毒粒子组装过程中具有破坏作用。本次实验中，M蛋白质C末端插入FLAG肽标签后同样可与共表达的E蛋白质在昆虫细胞胞浆内形成VLP，这表明本实验中，在M蛋白质最靠近C末加入的肽标签所致的M蛋白质突变不影响M蛋白质参与病毒颗粒组装过程。但仍然需更多试验数据确定SARA-CoV主要结构蛋白质特别是M蛋白质在病毒粒子组装过程中的功能。 综上所述，本文成功分离了SARS-CoV，从一例SARS死亡病例中克隆出全长SARS-CoV基因组并进行了全序列分析，通过病毒样颗粒的装配试验初步阐明了SARS-CoV结构蛋白质在病毒装配中的功能，这些工作为病毒的复制机制研究提供了线索。

目录

文摘

英文文摘

第一章SARS冠状病毒分子生物学进展

第二章SARS冠状病毒的分离培养和鉴定

第三章SARS病人肺组织中SARS-CoV全基因组cDNA克隆及序列分析

第四章SARS冠状病毒结构蛋白质基因的表达及其病毒样颗粒的包装试验

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