HvS/TPK基因的表达分析及反义HvS/TPK基因向小麦易位系92R137中的导入

摘要

小麦白粉病是由白粉菌(Ergsiphe greminis Dc.f.sp.tritici)引起的世界性真菌病害。选育和应用抗病品种是控制白粉病为害的有效途径。南京农业大学细胞遗传研究所发现小麦近缘物种簇毛麦对白粉病抗性强、抗谱广,通过染色体工程将簇毛麦携带的抗病基因导入到普通小麦中,并将该基因定位于6V短臂上,命名为Pm21。在Pm21基因的克隆研究中,曹爱忠等(2006)利用基因芯片技术克隆得到一个Pm21基因的候选基因HvS/TPK。为进一步研究HvS/TPK基因的表达和抗性机制,本研究对该基因进行了表达分析和反义HvS/TPK基因的转化研究。 1.HvS/TPK基因的表达分析 本研究通过几种胁迫处理和几种小分子化学物质处理小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系92R137植株,利用半定量RT-PCR的方法分析目的基因的表达特征。研究结果发现该基因不仅受白粉菌的诱导上调表达,而且还受乙烯利(10mM)和过氧化氢(H2O27mM)的诱导上调表达。这表明HvS/TPK基因的编码产物可能与乙烯抗病途径和体内活性氧的代谢存在一定关联。在其它几种处理包括接种赤霉菌、高温(40℃)、高盐(NaCl 300mM)以及水杨酸(5mM)诱导等处理中,基因HvS/TPK都没有上调表达,表明HvS/TPK基因对赤霉病胁迫、高温胁迫和盐胁迫不响应。同时,还发现基因HvS/TPK不仅在白粉菌诱导的叶片中上调表达,在白粉菌诱导的小麦穗部也会发生上调表达。 2.HvS/TPK基因在大肠杆菌中的表达 为深入研究基因HvS/TPK编码产物的功能,本研究成功构建了HvS/TPK的原核表达载体pET32a-HvS/TPK,并对原核表达条件进行了优化。本研究发现在ITPG诱导浓度为1.0～1.5mg/L、诱导温度为28℃和诱导时间为4h时,目的重组蛋白His-HvS/TPK表达量最高。该重组蛋白的分子量为55KDa左右,与预测大小一致。提取细菌总蛋白,将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析,发现His-HvS/TPK是以包涵体的形式存在。纯化后的蛋白可作为抗原,用于多克隆抗体的制备。还可以将纯化后的蛋白进行复性,用于体外激酶分析实验(in vitro kinase assay)。 3.基因HvS/TPK生物信息学研究 本研究利用NCBI网站上提供的序列分析软件和工具,对HvS/TPK基因及其编码产物进行了序列比对分析,发现在大麦、水稻和拟南芥中都存在一些与HvS/TPK基因具有较高同源性的基因(核苷酸序列不低于80％,氨基酸序列不低于50％),这些同源基因编码产物都具有推导的Ser/Thr激酶结构。利用NCBI网站上提供的蛋白保守结构域结构预测在线工具对HvS/TPK进行了分析,发现蛋白HvS/TPK N端3到153位置存在了一个激酶结构域。综合以上结果,可以推断HvS/TPK基因可能是Ser/Thr激酶基因家族中的一个新的亚家族成员。本研究还利用SWISS-MODEL在线工具和NCBI提供的Cn3D软件预测了HvS/TPK激酶域的三维结构模型和功能残基。推测发现HRDIKASNIL(79-88)氨基酸序列形成一个催化空间结构域,DFGLAKLLPP(99-108)、ISTRV(113-117)和GTLGYLAPE(119-127)三段氨基酸序列构成激活域,28Tyr、86Asn、88Leu和SDF(98-100)氨基酸残基在空间上形成ATP结合域,35Ser、83Lys、115Thr、116Arg、118Gly、120Leu和121Gly构成底物结合域。 4.反义HvS/TPK基因向抗白粉病材料92R137中的转化 利用基因枪轰击法将构建好的表达载体pAHC-HvS/TPKa轰击小麦幼胚1124个,经过多次筛选和分化,最后获得39株再生植株。根据目的基因、bar基因和启动子ubi两端序列设计引物,对再生的39株植株进行PCR鉴定,11株有阳性信号,转化频率为0.9％(阳性植株数/轰击的总幼胚数)。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分文献综述

第一章植物抗病反应中的分子识别与信号传导

1宿主对病原激发子的识别

2蛋白磷酸化在信号传递中的核心作用

3离子流冲和氧爆发

4植物抗病反应中内源次级信号分子

1展望

第二章转基因小麦的研究进展

1.小麦遗传转化受体系统的建立

2.小麦遗传转化的主要方法

3.小麦转基因技术的应用

4.小麦转基因研究存在的主要问题和展望

第二部分研究报告

第三章基因HvS/TPK的表达分析及其生物信息学研究

引言

1材料与方法

2结果与分析

3 讨论

第四章反义HvS/TPK基因向抗病材料92R137中的转化

引 言

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

全文结论

附录

参考文献

致谢