Aspergillus ficuum AF-98菊粉酶发酵条件的优化及酶的分离纯化研究

摘要

菊粉酶(Inulinase)是一类能够水解β-2，1-D-果聚糖果糖苷键的水解酶，在一定温度下水解菊粉生成果糖或低聚果糖，目前果糖和低聚果糖已被广泛应用于食品和医药工业，因此近年来菊粉酶的研究受到越来越多的重视。 本论文对实验室保藏的一株无花果曲霉AF-98产菊粉酶的液体发酵条件进行了研究，通过优化培养基和培养条件提高酶产量，并对该菌株所产菊粉酶进行了分离纯化，以及对该酶的酶学性质进行了初步研究。论文的主要研究内容和结论如下： 1.对菌株产菊粉酶的液体发酵条件进行了研究。采用单因素试验初步确定影响Aspergillus ficuum AF-98产菊粉酶的各单因子的较优水平，在此基础上，利用Box-Behnken响应曲面法和正交试验分别对影响该菌株发酵产酶的培养基组分和培养条件进行进一步优化。优化后的发酵条件为：菊粉20.25g/L、眎蛋白胨21.20g/L、(NH4)2SO45.3g/L、NaCl5g/L、MgSO4·7H2O0.5 g/L、ZnSO4·7H2O0.1 g/L，初始pH6.5、接种量6％、装液量50mL/250mL三角瓶、培养温度30℃、培养时间48h。在此条件下菊粉酶酶活达到158.44U/mL。 2.菊粉酶粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephacel离子交换层析和SephadexG-100凝胶层析等分离纯化方法，得到电泳纯的菊粉酶，该酶被提纯了7.06倍，酶回收率为4.9‰酶活力达到376.78U/mg。经SDS-PAGE电泳检测该菊粉酶为单链蛋白，相对分子量约为48KDa。 3.对菊粉酶的酶学性质进行了研究。实验结果表明：菊粉酶反应最适温度为60℃，最适pH为4.0，在60℃以下保温1小时仍具有75％以上的活性，在pH3.0～7.0的范围内室温保存1小时具有80％以上的稳定性；以菊粉为底物，Mn2+对酶活有微弱的促进作用，Co2+、Cu2+和Mg2+对酶活影响不大；K+对酶活有微弱的抑制作用，Ag+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Na+和EDTA对酶活有明显的抑制作用；以菊粉为底物的Km=35.72mg/mL，Vmax=16.34μmol·min-1mL-1；

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录

声明

第一章文献综述

前言

1菊粉酶的简介

1.1菊粉酶

1.2菊粉酶的分类

2菊粉酶的研究现状

2.1筛选高酶活、稳定性好的菌株

2.2进行诱变育种以选育高产突变株和去阻遏突变株

2.3产酶发酵条件及菊粉酶分离纯化的研究

2.4克隆并高效表达菊粉酶基因，构建基因工程菌

2.5固定化技术的采用

2.6超声波技术的应用

3菊粉酶的应用前景

3.1利用菊粉酶生产果糖和高果糖浆

3.2利用菊粉酶生产低聚果糖

3.3利用菊粉酶生产酒精

3.4其他

4本研究的主要内容

参考文献

第二章Aspergillus ficuum AF-98菊粉酶液体发酵条件的优化

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与讨论

2.1不同碳源对菌种AF-98产菊粉酶的影响

2.2菊粉浓度对菌株AF-98产菊粉酶的影响

2.3不同氮源对菌种AF-98产菊粉酶的影响

2.4眎蛋白胨浓度对菌株AF-98产菊粉酶的影响

2.5(NH4)2SO4浓度对菌株AF-98产菊粉酶的影响

2.6接种量对菌株AF-98产菊粉酶的影响

2.7温度对菌株AF-98产菊粉酶的影响

2.8装液量对菌株AF-98产菊粉酶的影响

2.9初始pH对菌株AF-98产菊粉酶的影响

2.10响应曲面设计实验优化发酵培养基

2.11正交实验优化菌株AF-98产酶的培养条件

2.12 AF-98菌体生长曲线

3本章小结

参考文献

第三章Aspergillus ficuum AF-98菊粉酶的分离纯化

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果与讨论

2.1硫酸铵分级沉淀

2.2透析脱盐

2.3 DEAE-Sephacel离子交换层析

2.4 Sephadex G-100凝胶过滤色谱

2.5菊粉酶的分离纯化小结

2.6菊粉酶的纯度鉴定和分子量测定

3本章小结

参考文献

第四章Aspergillus ficuum AF-98菊粉酶酶学性质的研究

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与讨论

2.1菊粉酶反应最适温度

2.2菊粉酶的温度稳定性

2.3菊粉酶反应最适pH

2.4菊粉酶的pH稳定性

2.5金属离子和其它化学物质对菊粉酶的影响

2.6菊粉酶动力学常数的测定

3本章小结

参考文献

全文结论

创新点

致谢

硕士学习期间发表的论文