断奶仔猪多系统衰竭综合征中多病原体混合感染的分子流行病学调查

摘要

断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)于1991年在加拿大被首次发现，并由Harding和Clark于1996年首次报道该病，随后美洲、欧洲和亚洲各国相继报道了该病。起初认为该病是由猪圆环病毒(PCV2)引起的一种以渐进性消瘦、淋巴结肿大、呼吸困难、偶尔出现腹泻、皮肤苍白及黄疸为特征的高度接触性传染病，主要侵害7～15周龄的断奶猪和生长猪，猪群患病率为3～30％，致死率高达80～100％。近年来，该病的发生呈上升趋势，给养猪业造成了巨大的经济损失.现已证实多病原体混合感染是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要致病因素，其中PCV2是PMWS的重要病原。混合感染中常见的病原体有:猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪输血传播病毒(PTTV）;最近各国学者在PMWS样品中还发现PCV2与新型细小病毒混合感染的现象，如:猪细小病毒4型(PPV4)、博卡病毒(PBoV)及猪Hokovirus(PHoV)等。
　　 本研究主要从流行病学角度，检测临床样品中各种病原体的感染率和混合感染的流行情况，并通过测序对主要的病原进行遗传变异分析，阐明混合感染中主要病原的分子流行病学和遗传变异规律。实验内容主要包括以下几个方面:
　　 1.PMWS多病原体的流行病学调查
　　 参照国内外已发表文献中引物，或根据GenBank上已发表病原体基因序列设计引物建立针对各病原体的PCR检测方法，对2009～2012年在江苏、浙江等省采集的1183份样品进行检测。结果显示PCV2的阳性率为47.00％(556/1183)，PBoV1的阳性率为22.49％(266/1183)，PBoV3-4的阳性率为15.56％(75/482)，PHoV的阳性率为19.86％(235/1183)，TTV1的阳性率为17.58％(208/1183)，TTV2的阳性率为19.86％(235/1183)，PPV4的阳性率为17.89％(102/570)，PRRSV的阳性率为28.32％(145/512)。不同角度统计的检测结果显示，发病样品中PCV2及PPV4的阳性率显著高于健康样本中的阳性率;发病样本中PCV2与其他病原体混合感染率与健康样本中的混合感染率差异显著;PCV2在30～60日龄样本中的检出率最高;发病样本不同组织脏器中，PCV2的阳性感染率都很高，差异不明显。
　　 2.PCV2流行株ORF2部分基因序列测定及遗传分析
　　 为了研究江苏省猪群PMWS主要病原PCV2流行毒株的遗传变异情况，以2009～2012年临床组织样品DNA为模板，对PCV2流行株ORF2的部分基因进行扩增、克隆和序列测定。并利用DNAman和DNAstar软件对测序结果进行比对。结果发现26株PCV2 ORF2部分基因序列同源性在87.1％～100％之间，与国内外经典毒株的同源性在83.3％～97.1％之间。同时利用PCV2全长基因组引物在粪便中扩增出1株PCV2完整序列(JSTZ-4)，GenBank登录号为JQ413808。在国内首次对粪便中的PCV2进行序列分析，结果显示该毒株与国内PCV2基因序列的同源性为95.0％～99.9％，与国外粪便中分离到PCV2基因序列的同源性为94.9％～97.9％。
　　 3.PBoV3-4型流行株部分基因序列测定及遗传分析
　　 猪博卡病毒是最新发现的一种DNA病毒，于2009年首次在瑞典患断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪体内被鉴定。为及时了解PBoV在我国的流行及遗传变异情况，本研究利用PCR方法扩增PBoV3-4亚型流行株的NS1部分基因序列，T克隆后进行测序，利用DNAstar软件对测序结果进行比对，发现与PBoV3(JG512472)的同源性在89.3％～95.8％之间;与PBoV4(JF512473)的同源性在86.8％～91.1％之间。系统进化树分析发现，9株与PBoV3(JG512472)在同一分支上，另外9株与PBoV4(JF512473)在同一分支上.
　　 4.PRRSV ORF5基因序列测定及遗传分析
　　 PRRSV作为一种RNA病毒，其基因组容易发生变异，因此掌握PRRSV的流行变异趋势对该病的防治是非常有意义的。本研究选用PRRSV ORF5作为靶基因，分析2011～2012年江苏省PRRSV流行株的遗传变异情况。结果显示这11株PRRSV ORF5基因序列与5株国内外代表毒株的同源性为86.5％～98.7％。与强致病性毒株JXA1的同源性最高，与美洲型毒株VR-2332的同源性最低。系统进化树分析也显示11株PRRSV与高致病性毒株在同一分支上。
　　 本实验通过PCR检测临床样品中各病原体的单一感染率及混合感染率，借助基因测序工作掌握主要病原体的遗传变异情况，深入研究PMWS的病原学，为控制该病提供理论指导和科学依据。

目录

声明

摘要

第一章 断奶仔猪多系统衰竭综合征研究进展

1 病原

2 流行病学

3 临床症状及病理变化

4 诊断

4．1 临床诊断

4．2 病理学诊断

4．3 实验室诊断

5 防治

参考文献

第二章 PMWS混合感染中常见病原体概述

1 猪圆环病毒2型(PCV2)

2 猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)

3 猪输血传播病毒(PTTV)

参考文献

第三章 PMWS中新型细小病毒概述

1 猪博卡病毒(PBoV)

2 猪Hokovirus(PHoV)

参考文献

第四章 PMWS多病原体PCR检测

1 材料

1．1 检测样品

1．2 酶、工程菌和主要试剂(盒)

1．3 主要仪器

1．4 主要溶液配方

1．5 引物设计与合成

2 方法

2．1 样品的处理

2．2 模板的提取及扩增

3 结果

3．1 PCR扩增结果

3．2 检测结果

4 结果分析与讨论

4．1 PCV2检测结果分析与讨论

4．2 PBoV检测结果分析与讨论

参考文献

第五章 PCV2流行株ORF2部分基因序列测定及遗传分析

1 材料

1．1 样品

1．2 酶、工程菌和主要试剂(盒)

1．3 主要仪器

1．4 主要溶液配方

1．5 分子生物学软件

1．6 PCV2基因序列全长引物

2 方法

2．1 目的片段的回收

2．2 重组质粒的构建

2．3 转化

2．4 重组质粒的提取鉴定

2．5 酶切鉴定

2．6 测序

3 结果

3．1 酶切鉴定结果

3．2 序列比对结果

3．3 系统进化树分析

4 结果分析与讨论

参考文献

第六章 PBoV3-4型流行株部分基因序列测定及遗传分析

1 材料

1．1 样品

2 方法

3 结果

3．1 酶切鉴定结果

3．2 序列比对结果

3．3 系统进化树分析

4 讨论

参考文献

第七章 PRRSV ORF5基因序列测定及遗传分析

1 材料

1．1 样品

1．2 酶、工程菌和主要试剂(盒)

1．3 主要仪器、溶液配方

1．4 引物设计及合成

2 方法

2．1 PCR反应

2．2 目的片段的回收、重组质粒构建、转化及质粒酶切、测序

3 结果

3．1 PCR产物电泳结果及酶切鉴定结果

3．2 序列比对结果

3．3 系统进化树分析

4 讨论

参考文献

全文总结

附录

致谢