西藏乳酸菌的分离筛选及对青贮饲料发酵品质的影响

摘要

西藏高原平均海拔在四千米左右，自然气候条件恶劣，牧草生长期短，生产水平低，难以为草食家畜提供充足饲草资源;近年来超载过牧，导致草地退化，加剧了西藏畜牧业发展的困境。西藏传统的农作物是青稞，近年来引进了紫花苜蓿、苇状羊茅、多年生黑麦草和玉米等牧草和农作物。在西藏农作物收获后的秸秆是一种重要的粗饲料来源，但直接饲喂存在适口性差、消化吸收利用率低等问题;通过青贮加工后，可使硬秆软化，部分粗纤维降解，青贮过程所产生的酸和醇具有香味可提高适口性，增加采食量。在生产混合青贮饲料时接种乳酸菌能够显著提高青贮饲料的发酵品质，改善青贮饲料的营养价值，对家畜的生产性能也有积极的促进作用。本研究旨在从在西藏制作的未使用任何添加剂自然发酵的青贮饲料中，分离筛选出适合生产优质青贮饲料使用的乳酸菌，运用生理生化方法和分子生物学方法对该乳酸菌进行鉴定，并对其发酵条件和发酵培养基进行优化。将此乳酸菌作为青贮接种剂加入青贮饲料中，研究其对青贮发酵品质的影响，研究接种乳酸菌后青贮饲料的瘤胃体外发酵特性，以及饲喂奶牛对生产性能的影响。试验分为五个部分:
　　 1乳酸菌的分离筛选与鉴定
　　 本试验旨在从西藏自然发酵的青贮饲料中分离筛选乳酸菌，并对所选菌株进行生理生化鉴定和分子生物学鉴定，确定出适合青贮饲料接种用的乳酸菌株。方法:用MRS培养基、GYP培养基从青贮饲料中分离出37个菌落，经初步试验筛选出8株做进一步生理生化试验，优选出2个菌株，并对所得菌株进行生理生化鉴定、16S rRNA基因序列鉴定及同源性分析。结果:2个目标菌株(TBT608、TBT717)经生理生化和16S rRNA基因序列鉴定、同源性分析后，确定TBT717为植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)、TBT608为粪肠球菌菌株(Enterococcus faecalis)。
　　 2乳酸菌发酵条件的优化
　　 本试验旨在通过单因素和正交试验相结合的方法，确定TBT717和TBT608菌株适合的碳源、氮源、发酵培养基配方和发酵条件。采用单因素分析试验方法对碳源蔗糖、葡萄糖和麦芽糖进行筛选，得出菌株TBT717和TBT608的合适碳源为葡萄糖;采用单因素分析试验方法对氮源蛋白胨、酵母粉和玉米浆粉进行筛选，得出菌株TBT717和TBT608的合适氮源为蛋白胨和酵母粉两种原料同时使用。植物乳杆菌TBT717的最佳培养温度为30℃，最佳接种量为2％，最适初始pH值为6.2。粪肠球菌TBT608的最佳培养温度为37℃，最佳接种量为2％，最适初始pH值为6.4。将筛选出来的碳源、氮源设计四因素三水平的正交试验，对两株菌的发酵培养基进行优化。得到植物乳杆菌TBT717的发酵培养基为:葡萄糖1.8％、蛋白胨1.2％、酵母粉1.8％、磷酸氢二钾0.3％、吐温-800.10％、MgSO4·7H2O0.058％、MnSO4·4H2O0.025％。粪肠球菌TBT608的发酵培养基为:葡萄糖2.0％、蛋白胨2.0％、酵母粉1.8％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-800.10％、MgSO4·7H2O0.058％、MnSO4·4H2O0.025％。并通过测定植物乳杆菌TBT717和粪肠球菌TBT608的生长曲线，确定出植物乳杆菌TBT717发酵停止菌体收获时间是16h，粪肠球菌TBT608发酵停止菌体收获时间是12h。
　　 3接种乳酸菌对青贮发酵品质改善效果的研究
　　 为了验证菌株TBT717(Lactobacillus plantram)和TBT608(Enterococcus faecalis)对青贮饲料发酵品质的作用效果，进行了本章试验。共有以下两部分内容:1.玉米秸秆分别与苇状羊茅、多年生黑麦草、青稞秸秆、小麦秸秆、紫花苜蓿和箭筈豌豆混合青贮。试验采用容积为1L的实验室青贮窖，设对照和乳酸菌接种处理组，测定各组不同时间点的发酵品质，检测青贮过程中发酵品质的动态变化。玉米秸秆与不同饲草混合青贮试验结果表明:接种乳酸菌均不同程度地改善了混合青贮发酵品质，均提高了乳酸含量和乳酸/乙酸值，提高了水溶性碳水化合物利用效率，降低了乙酸含量和总挥发性脂肪酸含量，同时对青贮过程中丁酸和氨态氮的产生有抑制作用，减少了青贮饲料营养成分损失。2.玉米秸秆单独青贮试验采用生产用地上式青贮窖，在青贮150天后打开青贮窖，分析发酵品质，试验结果表明:接种乳酸菌大幅改善了玉米秸秆青贮发酵品质，显著提高了干物质、乳酸和粗蛋白含量，显著降低了乙酸、pH值和氨态氮/总氮值，乳酸菌处理组仅检测到微量丙酸，且未检测到丁酸。结果显示无论玉米秸秆混合青贮还是单独青贮，接种乳酸菌均改善了青贮发酵品质，这可能是由于接种的两种乳酸菌均为同质型乳酸菌，青贮过程中额外接种的乳酸菌利用水溶性碳水化合物的效率高于青贮材料本身附着的乳酸菌，乳酸生成增多，促使青贮饲料pH值快速下降，抑制了有害微生物的活性，进而减少了丙酸及丁酸的产生和蛋白质的降解。
　　 4接种乳酸菌玉米秸秆青贮饲料瘤胃体外发酵特性研究
　　 本试验研究了接种乳酸菌的试验组青贮饲料和未接种乳酸菌自然发酵的对照组青贮饲料分别与3种不同比例可溶性淀粉搭配（青贮饲料(∶)淀粉为3∶0、2∶1、1∶2），接种瘤胃液厌氧发酵24 h和48 h的体外干物质降解率(IVDMD)、发酵液pH值、氨态氮含量、挥发性脂肪酸等发酵特性。此试验中，可溶性淀粉代表精料，玉米青贮饲料代表唯一的粗饲料，发酵特性检测时间点是发酵24h和48h。结果显示，接种乳酸菌后的青贮饲料能够增加体外干物质降解率(IVDMD)，接种乳酸菌的试验组青贮饲料与未接种乳酸菌自然发酵的对照组青贮饲料相比，其发酵液pH值较稳定，挥发性脂肪酸的乙酸丙酸比值降低。
　　 5青贮饲料对奶牛奶产量及乳成分的影响
　　 试验选用20头经产荷斯坦奶牛（胎次2.56±0.38，体重590±18 kg，日产奶量20.07±2.39 kg/d），采用完全随机区组分为2组，预饲期10天，正试期30天，分别在正试期的开始和结束时统计产奶量并采集奶样，研究饲喂接种乳酸菌后的玉米秸秆青贮饲料与自然发酵的玉米秸秆青贮饲料对荷斯坦奶牛产奶量及乳成分的影响。结果显示:奶牛饲喂接种乳酸菌调制的玉米秸秆青贮饲料，可在一定程度上提高乳产量及乳脂肪、乳蛋白质和非脂乳固体物含量和产量。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语

前言

第一篇 文献综述

第一章 青贮微生态与乳酸菌

1 青贮体系微生态

2 乳酸菌

第二章 乳酸菌在青贮饲料中的应用

1 乳酸菌青贮接种剂

2 乳酸菌对青贮发酵品质的影响

3 接种乳酸菌的青贮饲料对动物生产性能的影响

第三章 研究的目的意义和主要内容

1 研究背景

2 研究目的和意义

3 研究内容

第二篇 试验部分

第一章 西藏乳酸菌的分离筛选与鉴定

第一节 西藏乳酸菌的分离

第二节 乳酸菌的生理生化鉴定和分子生物学鉴定

第二章 乳酸菌发酵条件的优化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 结论

第三章 接种乳酸菌对青贮饲料发酵品质的影响

第一节 接种乳酸菌对苇状羊茅、多年生黑麦草与玉米秸秆混合青贮发酵品质的影响

第二节 接种乳酸菌对青稞秸秆、小麦秸秆与玉米秸秆混合青贮发酵品质的影响

第三节 接种乳酸菌对紫花苜蓿、箭筈豌豆与玉米秸秆混合青贮发酵品质的影响

第四节 接种乳酸菌对玉米秸秆青贮发酵品质的影响

第四章 接种乳酸菌的玉米秸秆青贮饲料瘤胃体外发酵特性研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 结论

第五章 青贮饲料对奶牛奶产量及乳成分的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 结论

全文结论及创新点

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表和投递的论文

附录