簇毛麦染色体分子核型及染色体结构变异体库的构建

摘要

簇毛麦（Haynaldia villosa L.）是小麦的一个野生近缘种，抗白粉病、锈病、全蚀病、眼斑病及黄花叶病等多种病害，同时还兼有抗寒耐旱、分蘖力强、密穗多花、籽粒蛋白质含量高等特性，是小麦遗传改良的优良基因源。为了定位、转移和利用簇毛麦的有益基因，本研究以硬粒小麦-簇毛麦双倍体花粉辐射的回交自交后代为材料，首先利用基因组原位杂交筛选小麦背景中只存在一种形式的簇毛麦染色体结构变异体，而后利用簇毛麦各条染色体的特异分子标记对这些结构变异体的身份进行鉴定，以此构建“普通小麦-簇毛麦染色体结构变异体库”。
　　 第一部分:普通小麦-簇毛麦二体异附加系的选育与鉴定
　　 目前国际上有2套完整的簇毛麦二体异附加系，其簇毛麦来源与本研究所用的簇毛麦不同，农艺性状或优异特性也具有一定的差异。本研究在（中国春/硬粒小麦-簇毛麦双倍体（60Co-γ射线照射花粉）∥中国春）的杂交回交后代中，应用基因组原位杂交和分子标记分析技术，从BC3F2和BC4F2代中选育并鉴定出分别涉及簇毛麦7条染色体的纯合二体附加系，花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ染色体构型观察表明添加的一对簇毛麦染色体配对成环状或棒状二价体。利用选育鉴定的一套普通小麦-簇毛麦二体异附加系可以定位簇毛麦的优异基因。
　　 第二部分:簇毛麦染色体分子棱型的建立
　　 对导入普通小麦背景中的簇毛麦染色体或染色体片段的准确鉴定是利用簇毛麦优异基因的前提。本研究旨在利用2个重复序列(pSc119.2、pAs1)和2个rDNA多基因家族(45S rDNA、5S rDNA)作为探针建立二倍体簇毛麦(VV,2n=14)染色体的分子核型，以用于鉴定小麦背景中的簇毛麦染色体或染色体片段。荧光原位杂交结果显示45S rDNA和5S rDNA分别只在簇毛麦1VS和5VS上有杂交信号，可分别作为1VS和5VS的细胞学标记;pSc119.2在簇毛麦7条染色体上都有杂交信号，信号分布于染色体的末端或亚末端，但有2对染色体只在短臂上有杂交信号，其信号的分布可区分簇毛麦全部7条染色体;pAs1在簇毛麦7条染色体上也都有杂交信号，信号较为丰富，分布于染色体的末端、亚末端、中部和着丝粒区域。利用2个重复序列pSc119.2、pAs1和2个rDNA多基因家族45S rDNA、5S rDNA对一套簇毛麦二体附加系进行荧光原位杂交分析，建立了由4种重复序列作探针的簇毛麦染色体分子核型。
　　 第三部分:簇毛麦染色体结构变异体库的构建
　　 别同德和曹亚萍先后利用60Co-γ射线照射硬粒小麦-簇毛麦双倍体即将成熟的花粉，然后授给已去雄的普通小麦中国春，在M1代即用基因组原位杂交检测到大量的簇毛麦染色体结构变异，并且大多数结构变异体能在后代中稳定传递。为获得尽可能多的结构变异体，我们首先利用基因组原位杂交筛选在小麦背景中只含有一种类型簇毛麦染色体结构变异的变异体，目前已筛选到140份结构变异体，其中小片段易位41份、大片段易位32份、整臂易位44份、缺失18份和簇毛麦插入型易位5份;随后在这些结构变异体的自交后代中，鉴定出了30份纯合体，包括小片段易位7份、大片段易位9份、整臂易位10份、缺失2份及簇毛麦插入型易位2份。
　　 为了更有效地鉴定这些簇毛麦染色体结构变异体，我们对簇毛麦的特异标记进行了加密，在选取的1576对引物中，共筛选到89个簇毛麦染色体特异标记，其中1V特异标记有2个、2V特异标记有14个、3V特异标记有8个、4V特异标记有8个、5V特异标记有41个、6V特异标记有2个及7V特异标记有14个。由于本实验室缺少涉及3V和7V的端体或整臂易位材料，我们利用pSc119.2和pAs1对2个端体和2个整臂易位材料进行双色荧光原位杂交分析，再与标准的簇毛麦染色体分子核型比较，结果表明单株TV60-1-8-27和TV60-1-8-18分别是3V的短臂和长臂的端体，单株TV54-5-5-22和TV54-5-5-21分别是7V短臂和长臂的整臂易位，利用这几个非整倍体材料我们将3V和7V染色体的特异标记定位到相应的染色体臂上，其中8个标记被定位到3VS上、1个标记被定位到3VL上;另外11个标记被定位到7VS上、7个标记被定位到7VL上。
　　 最后利用现有的分布于簇毛麦各条染色体上的124个特异标记，对这些结构变异体所涉及的簇毛麦的身份及变异区段进行了鉴定。目前，我们明确了67个结构变异体所涉及的簇毛麦染色体身份及变异区段，其中涉及1V的有8个、2V的有11个、3V的有5个、4V的有10个、5V的有9个、6V的有13个及7V的有11个，这些结构变异体涉及了簇毛麦不同的染色体区段，在此基础上初步构建了“普通小麦-簇毛麦染色体结构变异体库”。另外我们还将簇毛麦的特异标记定位到染色体的不同区段上;利用该库中涉及2VS的结构变异体结合表型观察，我们将簇毛麦的控制颖脊刚毛基因定位于2VS FL:0.00-0.33处。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

一 外源有益基因导入小麦研究进展

1 小麦属的分类、起源与进化

2 小麦的基因资源

3 小麦-外源易位染色体的诱导

二 簇毛麦有益基因的转移和利用

1 簇毛麦的利用价值

2 簇毛麦的核型研究及其与小麦属其它染色体组的关系

3 簇毛麦有益基因导入小麦研究进展

三 普通小麦背景中外源染色体(或片段)的鉴定

1 形态学标记

2 细胞学标记

3 生化标记

4 分子标记

四 原位杂交在植物基因组研究中的应用

1 原位杂交技术(in situ hybridization，ISH)的分类

2 原位杂交的靶DNA类型

3 常用的探针标记系统

4 FISH技术在植物基因组研究中的应用

第二部分 研究报告

第一章 普通小麦-簇毛麦二体附加系的选育与鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二章 簇毛麦染色体分子核型的建立

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 普通小麦-簇毛麦染色体结构变异体库的构建

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

全文结论

论文创新点

参考文献

附录 簇毛麦各条染色体基于PCR的特异分子标记

致谢