猪流行性腹泻病毒间接ELISA方法的建立和病毒样颗粒的构建及免疫特性分析

摘要

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。该病已给各国的养猪业造成了严重的经济损失，因此关于其疫苗的研制迫在眉睫。本研究制备了PEDVM和S蛋白的多克隆抗体，利用原核表达的S蛋白建立了间接ELISA方法，还利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达了M、E和S蛋白，成功构建了PEDV病毒样颗粒(VLPs)，并对其免疫特性进行了研究，PEDV VLPs的构建和免疫特性研究为PEDVVLPs疫苗的研制奠定了基础。具体研究内容如下:
　　1.猪流行性腹泻病毒M和S蛋白多克隆抗体的制备及鉴定
　　本研究采用PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白和S蛋白的亲水区基因进行扩增，扩增片段（命名为Ma和Sa）分别克隆到原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1中，获得的重组质粒pET-32a-Ma和pGEX-6p-1-Sa转化大肠杆菌BL-21菌株，经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳及Western-blot鉴定。表达产物经SDS-PAGE电泳后切胶免疫小鼠制备多克隆抗体，间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清效价，Western-blot和间接免疫荧光检测抗体的特异性。结果表明目标蛋白获得了正确表达，且制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。PEDV Ma和Sa蛋白的表达及多克隆抗体的制备将为进一步构建PEDV的病毒样颗粒(VLPS)抗原和建立血清学检测方法奠定了基础。
　　2.PEDV Sc蛋白间接ELISA方法的建立及其与中和试验相关性的研究
　　本研究应用原核表达载体pET-28a(+)表达了PEDV S蛋白的截短片段(命名为Sc)，并利用纯化的Sc蛋白建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法。通过筛选确定，抗原最佳包被浓度为1μg/mL，包被条件为37℃2h，最佳封闭液为5％脱脂乳，封闭时间为2h，血清最佳稀释度为1∶100，作用时间为1h，二抗最佳稀释度为1∶20000，作用时间为45 min，最佳显色时间为15 min。通过对80份PEDV阴性血清间接ELISA结果进行统计学分析，确定本方法的判定标准为:当OD450nm≥0.259时判为阳性，当OD450nm≤0.223时判为阴性，介于两者之间判为可疑。本方法的批内重复性和批间重复性变异系数均小于10％敏感性实验证明5份阳性血清1∶3200稀释后检测仍为阳性，说明本方法具有良好的重复性和敏感性。使用本研究建立的间接ELISA方法检测PRV、PCV2、FMDV、PRRSV和CSFV的标准阳性血清，结果均为阴性，说明本方法具有良好的特异性。运用本方法筛选的OD450nm值递减的7份血清样品做中和试验，结果中和抗体效价基本保持递减趋势，说明本研究建立的间接ELISA方法可信度高，可用于检测PEDV中和抗体。
　　3.PEDV病毒样颗粒的构建和免疫原性的研究
　　本研究通过PCR方法扩增了PEDV的M、E和S基因，先后将M和E基因克隆到昆虫杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac Dual的PH和p10启动子后，构建重组质粒pFast-ME，将S基因克隆到pFastBac Dual的PH启动子后，构建重组质粒pFast-S。分别将重组质粒pFast-ME和pFast-S转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，经2轮蓝白斑筛选和PCR鉴定，获得正确的重组杆粒Bacmid-ME和Bacmid-S。在脂质体的介导下，分别用Bacmid-ME和Bacmid-S转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBME和rBS。用重组杆状病毒rBME和rBS共同感染Sf9细胞，收获细胞后经Western-blot鉴定，M、E和S蛋白均得到正确表达。将共感染收获的细胞经蔗糖密度梯度离心纯化后电镜观察，结果证明M、E和S3种蛋白可以组装形成PEDV病毒样颗粒。将VLPs样品制成疫苗，免疫小鼠，通过ELISA实验和中和试验检测发现VLPs能诱导机体产生ELISA抗体和中和抗体。以上结果说明杆状病毒表达的M、E和S蛋白在昆虫细胞中组装形成了VLPs，为研制VLPs疫苗奠定了基础，具有良好的应用前景。
　　综上所述，本研究制备了PEDV M和S蛋白的多克隆抗体，利用截短表达的S蛋白建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法，并成功利用杆状病毒表达的M、E和S蛋白在昆虫细胞中组装形成了VLPs，为PEDV血清学诊断技术和VLPs疫苗的研制奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 猪流行性腹泻病毒的研究进展

1 PEDV分子生物学特性

1．1 病毒的形态学及理化特性

1．2 PEDV培养特性

1．3 基因组结构及编码蛋白

2 PEDV分子流行病学

3 诊断技术

4 疫苗

4．1 传统疫苗

4．2 基因工程疫苗

4．3 联苗

5 治疗

参考文献

第二章 猪流行性腹泻病毒M和S蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 Ma和Sa基因的扩增

2．2 重组质粒pET-32a-Ma和pGEX-6p-1-Sa的酶切鉴定

2．3 Ma和Sa蛋白的诱导表达和鉴定

2．4 多克隆抗体效价的测定

2．5 多克隆抗体的Western-blot鉴定

2．6 多克隆抗体的IFA鉴定

3 讨论

参考文献

第三章 PEDV Sc蛋白间接ELISA方法的建立及其与中和试验相关性的研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 目的基因的扩增及重组质粒的鉴定

2．2 Sc蛋白的表达、鉴定和纯化

2．3 间接ELISA最佳反应条件的确定

2．4 间接ELISA临界值的确定

2．5 间接ELISA的重复性、敏感性和特异性试验

2．6 间接ELISA结果和中和试验结果的相关性

3 讨论

参考文献

第四章 猪流行性腹泻病毒(PEDV)病毒样颗粒(VLPs)的构建和免疫原性研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 目的基因的PCR扩增

2．2 重组质粒的构建与鉴定

2．3 重组Bacmid的PCR鉴定

2．4 重组杆状病毒的获得

2．5 重组蛋白的Western-blot鉴定

2．6 蔗糖密度梯度离心

2．7 电镜观察

2．8 ELISA抗体效价

2．9 中和抗体效价

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢