除草剂中间体4-羟基苯氧基丙酸降解菌的分离鉴定及其降解途径研究

摘要

农业现代化的发展引发除草剂过度使用，由此而引发的环境污染问题日益受到人们的关注。低效率吸收的除草剂经过雨水淋溶后，导致大量的土壤残留。作为自然界广泛存在的分解者，微生物以其多变的适应能力扮演着重要的土壤生态修复工具的角色。因此，除草剂降解微生物的研究已成为热点。作为近年来世界范围内大量使用的除草剂之一，芳氧苯氧丙酸类除草剂2011年的销售额占据了全球农药市场的2.1％，占据全部除草剂市场的4.8％。虽然除草剂的施用降低了农田杂草危害，但是大量未吸收除草剂对环境造成了严重的残留污染。本研究以精恶唑禾草灵降解中间体(R)-(+)-2-（对羟基苯氧基）丙酸[(R)-(+)-2-(4-HydroxyPhenoxy)Propanoate，HPP]为基质，从长期受污染的化工厂污泥中分离和筛选降解微生物，并通过对降解微生物降解代谢和遗传背景的研究，为此类除草剂污染的土壤生态修复和抗除草剂转基因作物的开发提供代谢研究基础和微生物资源。
　　从长期受污染的化工厂污泥中分离出能够快速降解HPP的三株菌，命名为MEPE0129，MEPE0902和MEPE0903。根据表型特征、生理生化特性及16SrRNA基因系统发育分析，分别将MEPE0129鉴定为红螺菌科(Rhodospirillaceaegen.sp.)菌株，将MEPE0902鉴定为丛毛单胞菌科戴尔福特属(Delftiasp.)菌株，将MEPE0903鉴定为产碱菌科的噬色素菌属（Pigmentiphagasp.）菌株。MEPE0129，MEPE0902和MEPE0903的生长需要氧气，最适生长温度均为37℃，最适生长pH分别为6.0-7.0，7.0和7.0。当NaCl浓度小于3％时，菌体生长良好。
　　16SrRNA基因同源性比对表明，MEPE0129的16SrRNA基因序列与目前报道菌株最高同源性仅为91.17％。建树分析后发现该菌在红螺菌科内形成了一个新的分支，该分支不同于科内其他属的模式菌株。进一步对MEPE0129进行了Biolog系统和API系统分析。同时分析了该菌株的脂肪酸，G+Cmol％含量，极性酯，呼吸醌成分。MEPE0129DNAG+C含量为65.1mol％，主要呼吸醌为Q10(75％)，主要脂肪酸组分为C18∶1ω7c，C16∶0和C19∶0cycloω8c。与同科其他属模式菌株比较后，发现MEPE0129拥有独特的生理生化特征。因此建立以MEPE0129为模式种的新属，命名为Taonellamepensis(=CICC10529T=CCTCCAB2012861T=KACC16940T)。
　　对MEPE0129，MEPE0902和MEPE0903分别进行了以HPP为唯一碳源，最适温度，最适pH，不同接种量，不同基质初始浓度和不同金属离子条件的降解实验。实验结果表明MEPE0129可以在13d内利用50mg·L-1生长，最高生长OD600nm可以达到0.1。MEPE0902可以在14h内利用高达450mg·L-1的HPP进行生长，相应的菌株生长浊度OD600nm由0.027上升至0.53。MEPE0903可以在8天内将50mg·L-1的HPP降解96％，同时菌体干重上升至90mg·L-1。MEPE0129，MEPE0902和MEPE0903的最适降解温度分别为28℃，37℃和30℃，其中MEPE0129在低于28℃的低温条件下有显著降解。三株菌的最适降解pH分别为8.0，7.0和8.0，且都在偏碱环境中有良好的降解效果。不同初始HPP浓度实验表明，高接种量的MEPE0129可以在6d内降解125mg·L-1的HPP，MEPE0902可以在15h内降解高达500mg·L-1的HPP。而MEPE0903仅能降解50mg·L-1的HPP，在100mg·L-1及其以上浓度时，MEPE0903失去降解能力。不同初始接种量实验表明，在选定的接种量范围内，三株菌对于HPP的降解效率随着接种量的升高而升高。金属离子实验表明，Cu2+和Ni2+对于三株降解菌的降解有抑制作用，而Co2+对于MEPE0902的降解抑制作用更加显著。
　　研究了MEPE0902中对苯二酚(HQ)的单独降解，对苯二酚与HPP的诱导降解，对苯二酚与HPP的混合降解和HPP降解的中间产物。在50mg·L-1对苯二酚的无机盐培养基中，对苯二酚能被MEPE0902转化为未知且无法利用的中间产物。对苯二酚和HPP的诱导和混合降解实验表明，两种物质对于对方的降解没有显著影响。最终，通过浓缩降解发酵液的方法，我们检测到了中间产物对苯二酚，确定了HPP在MEPE0902中的降解是以微量对苯二酚为中间代谢产物的新型降解途径。
　　为了研究MEPE0129和MEPE0902中多种可能的HPP降解代谢途径，分析了降解菌中的偏苯三酚开环酶活性。实验表明菌株MEPE0129和MEPE0902的破碎粗酶液具有偏苯三酚开环酶活性。利用保守引物以MEPE0129基因组DNA为模板扩增，得到了MEPE0129中偏苯三酚开环酶基因片段。继而通过Sefa-PCR和Tail-PCR侧翼扩增得到了6.8k的芳香族化合物降解基因簇。克隆了完整的MEPE0129偏苯三酚开环酶基因hppC，连接至pET-29a载体进行表达。表达的HppC比酶活低于粗酶中偏苯三酚开环酶比活，说明MEPE0129中可能存在其他的偏苯三酚开环酶。

目录

声明

摘要

符号与缩略语说明

前言

第一章 文献综述

1 芳氧苯氧丙酸类除草剂的简介，制毒机理和微生物降解过程

1．1 芳氧苯氧丙酸类除草剂的简介

1．2 芳氧苯氧丙酸类除草剂的制毒机理

1．3 芳氧苯氧丙酸类除草剂在环境中的残留

1．4 APP类除草剂的化学分解

1．5 芳氧苯氧丙酸类除草剂的微生物降解途径

2 苯氧羧酸类除草剂简介及其微生物降解

2．1 苯氧羧酸类除草剂简介

2．2 2，4-滴的微生物降解

2．3 2，4-滴丙酸和二甲四氯丙酸的微生物降解

3 红螺菌科的分类及降解菌株

4 4-羟基苯氧基丙酸微生物降解存在的问题及发展方向

参考文献

第二章 (R)-(+)-2-(对羟基苯氧基)丙酸降解菌的分离与鉴定

第一节 HPP降解菌的分离与鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

第二节 HPP降解菌株MEPE0129分类学地位研究

1 材料与方法

2 结果与分析

本章讨论

本章小结

参考文献

第三章 降解菌对(R)-(+)-2-(对羟基苯氧基)丙酸的降解特性及降解途径研究

第一节 HPP降解菌的降解特性

1 材料与方法

2 结果与分析

第二节 菌株MEPE0902的HPP降解途径

1 材料与方法

2 结果与分析

本章讨论

本章小结

参考文献

第四章 (R)-(+)-2-(对羟基苯氧基)丙酸降解菌的粗酶活性与芳香族转化酶基因克隆与分析

1 材料与方法

1．1 菌株、培养基与试剂

1．2 菌株MEPE0129和MEPE0902粗酶液的制备和检测

1．3 菌株总DNA的提取

1．4 MEPE0129中偏苯三酚降解基因片段的克隆

1．5 侧翼序列的克隆

1．6 PCR产物加A尾

1．7 PCR产物的T／A克隆

1．8 感受态细胞的制备和转化

1．9 质粒DNA的小量提取

1．10 序列测定

1．11 基因序列比较与分析

1．12 偏苯三酚开环酶基因表达载体的构建

1．13 偏苯三酚开环酶的诱导表达和SDS-PAGE分析

1．14 偏苯三酚开环酶的比酶活测定

2 结果与分析

2．1 MEPE0129和MEPE0902的粗酶液实验

2．2 MEPE0129中偏苯三酚降解基因片段与相关基因簇的扩增与分析

2．3 偏苯三酚开环酶基因的表达与活性测定

本章讨论

本章小结

参考文献

全文总结

主要创新点

下一步工作设想

附录

攻读博士学位期间发表的论文

致谢