猪流行性腹泻病毒传统毒株和变异毒株PCR鉴别诊断方法的建立与应用

摘要

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻、脱水为主要特征，病原为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)。2010年底以来，我国南方多省暴发PED，仔猪感染率达100％，致死率80％～100％，造成了巨大的经济损失。近几年，研究人员通过分离PEDV流行毒株和全基因测序发现，流行毒株与传统毒株CV777相比，基因组变异较大，尤其是S基因，存在碱基插入、缺失和突变。本研究根据PEDV传统毒株和变异毒株S基因特征，并参照实验室已建立的方法，设计合成了引物，建立了可以同时鉴别PEDV流行毒株和传统毒株的real-time PCR和RT-PCR方法，并将两种方法进行比较，结果显示，两种方法均可鉴别诊断PEDV传统毒株和变异毒株，real-time PCR更为敏感。
　　本研究具体内容如下:
　　1.PEDV传统毒株和变异毒株PCR鉴别检测方法的建立
　　本研究根据PEDV传统毒株和变异毒株S基因序列，并参照实验室已建立的方法，设计合成了引物，通过部分条件的优化，分别建立了能鉴别两种毒株的real-time PCR和RT-PCR方法。通过敏感性、重复性、特异性等试验对两种方法进行了比较。特异性实验结果显示:两种PCR方法均可以鉴别诊断PEDV传统毒株和变异毒株，并能区分PEDV与其他病毒，具有良好的特异性;常规RT-PCR方法检测PEDV传统毒株和变异毒株的最小浓度均为4×105copies/μl，real-time PCR方法检测传统毒株和变异毒株的最小浓度为4×102copies/μl，是常规RT-PCR敏感性的1000倍;real-time PCR方法，起始模板浓度与Ct值之间具有良好的线性关系，相关系数R2大于0.996;重复性试验中，real-time PCR变异系数小于2‰用常规RT-PCR对4份样品进行三次重复检测，结果一致。上述结果表明，两种方法均可以鉴别诊断PEDV的传统毒株和变异毒株，并具有良好的特异性、敏感性和重复性。通过比较，real-time PCR方法具有更好的敏感性。
　　2.两种PCR方法的临床应用
　　为比较两种PCR方法的临床应用效果，分别用real-time PCR方法和常规RT-PCR方法对采集的72份腹泻样品进行检测。结果如下:real-time PCR方法检测到51份阳性，其中传统毒株12份，变异毒株39份;常规RT-PCR方法检测到26份阳性，其中传统毒株3份，变异毒株23份。且传统RT-PCR检测到的阳性病料，real-time PCR方法检测也都为阳性。根据real-time PCR的检测结果，经计算分析，传统RT-PCR只能检测到高于104 copies/μl的病料。试验结果表明两种方法均可用于临床检测，real-time PCR比常规RT-PCR方法更敏感，更适于临床检测。

目录

声明

摘要

第一章 猪流行性腹泻病毒研究进展

1．1 病毒分类

1．2 形态结构

1．3 理化特性

1．4 细胞培养特性

1．5 病毒蛋白与功能

2 流行病学

3 临床症状及病理变化

4 诊断

4．1 病毒分离与鉴定

4．2 PCR方法

4．3 微量血清中和试验

4．4 免疫电镜法

4．5 免疫组化技术

4．6 免疫荧光技术

4．7 酶联免疫吸附试验(ELISA法)

5 防控

5．1 加强词养管理

5．2 返饲治疗

5．3 抗体治疗

6 疫苗研究

6．1 PED灭活疫苗

6．2 PED弱毒苗

6．3 乳酸杆菌疫苗

6．4 转基因植物疫苗

参考文献

第二章 荧光定量PCR的研究进展

1 荧光定量PCR的原理

2 荧光定量PCR的分类

2．1 水解探针法

2．2 荧光染料法

3 实时荧光定量PCR技术在动物疫病诊断上的应用

参考文献

第三章 PEDV传统毒株和变异毒株PCR鉴别检测方法的建立

1 材料和方法

1．1 病料与毒株

1．2 试剂及仪器

1．3 引物和探针

1．4 变异毒株和传统毒株阳性模板的制备

1．5 Real-time PCR方法的建立

1．6 常规RT-PCR方法建立

2 实验结果

2．1 阳性模板的制备

2．2 Real-time PCR方法的建立

2．3 常规RT-PCR方法的建立

3 讨论

参考文献

第四章 两种PCR方法的临床应用

1．1 病料

1．2 试剂和仪器

1．3 病料处理及RNA的提取

1．6 real-time PCR检测病料

1．7 两种PCR检测方法结果对比分析

2 实验结果

2．3 两种检测方法结果对比

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢