生土豆淀粉日粮对猪结肠和肝脏基因表达和代谢的影响

摘要

抗性淀粉在健康动物小肠不被分解利用，主要在后肠被微生物发酵利用。抗性淀粉后肠发酵过程中，会影响后肠菌群结构，同时产生短链脂肪酸(SCFA)等代谢产物，并可进一步影响动物机体代谢。生土豆淀粉因特殊的淀粉颗粒球不易被动物的消化酶消化，形成抗性淀粉，本论文通过长期饲喂生长育肥猪生土豆淀粉日粮，旨在研究抗性淀粉在肠道和肠道外层面如何影响猪机体的代谢过程，试验包括四个部分。
　　1.生土豆淀粉日粮对猪结肠微生物结构的影响
　　本试验通过高通量测序技术，研究抗性淀粉对鲒肠微生物菌群组成结构的影响，旨在探讨其潜在营养调控机制。试验选取36头（70日龄）杜长大三元杂交阉公猪，随机分成玉米淀粉组和生土豆淀粉组，每个组设6个重复（栏），每栏3头猪。玉米淀粉组日粮为玉米豆粕型日粮，生土豆淀粉组日粮以生土豆淀粉(RPS)替换等量玉米淀粉(CS)(生长期替换250 g/kg，育肥期替换280 g/kg)，饲喂期为100天，试验猪自由采食和饮水。试验结束后，每个重复随机屠宰一头，采集结肠黏膜和食糜，提取微生物DNA，采用16S rRNA基因测序技术，对结肠黏膜和食糜中菌群相对丰度进行分析，并通过荧光实时定量PCR测定细菌总数。结果显示，长期饲喂生土豆淀粉显著降低了猪结肠黏膜和食糜中总菌的数量(P＜0.05);在门水平上，生土豆淀粉对结肠菌群没有显著影响(P＞0.05)。在属水平上，与玉米淀粉日粮相比，生土豆淀粉日粮显著降低了梭菌属、密螺旋体属、颤螺菌属和理研菌属的丰度，但是显著升高了Turicibacter、Blautia和瘤胃球菌属的丰度(P＜0.05)，显降低了结肠菌群丰富度(P＜0.05)。结果提示，长期饲喂生土豆淀粉（高抗性淀粉）可有效调节结肠菌群结构，对后肠健康有一定益处。
　　2.生土豆淀粉日粮对猪结肠黏膜转录表达谱的影响
　　本试验利用表达谱基因芯片技术，全面测定结肠黏膜基因转录变化，旨在研究抗性淀粉对结肠转录层面的影响。试验设计同试验一，屠宰后，采集结肠黏膜，提取黏膜RNA，进行表达谱基因芯片分析。结果显示:按照特定筛选条件(差异倍数＞2或＜0.5，P＜0.05)，筛选出549个可功能注释的差异表达基因（生土豆淀粉组vs土豆淀粉组），其中311个基因转录上调，238个转录下调。差异基因显著富集了免疫反应通路、信号分子传导、运输和分解以及细胞信息交流等多个代谢通路。其中，生土豆淀粉显著升高了促炎因子IL-1β基因mRNA的表达量(P＜0.05)，降低了LIPA、GALANS、CTSZ、CTSB和CTSD等多个溶酶体通路关键酶对应基因mRNA表达量(P＜0.05)，抑制了病毒识别因子TLR-7基因mRNA的表达量(P＜0.05)。综上所述，长期饲喂生土豆淀粉，在转录层面抑制了结肠组织免疫相关通路，减弱了结肠免疫作用功能。
　　3.生土豆淀粉日粮对猪肝脏组织转录表达谱的影响
　　肝脏是动物机体重要的代谢器官，研究肝脏代谢能为机体研究提供重要参考。本试验选择肝脏作为抗性淀粉肠道外靶器官，运用表达谱基因芯片技术，分析肝脏基因转录变化，在转录层面研究长期饲喂生土豆淀粉对肝脏代谢的影响，揭示生土豆淀粉对机体肠外代谢的影响。试验设计同试验一，猪屠宰后，快速采集肝脏组织，用于基因芯片分析，并对特定基因进行荧光定量PCR验证。结果显示:按照特定条件（差异倍数＞1.5或＜0.67，P＜0.05），筛选注释得到237个差异表达的基因，包括121个上调基因，116个下调基因。差异表达的基因显著富集了脂肪氧化分解、磷脂合成、脂肪生成等脂肪代谢通路(P＜0.01)。长期饲喂生土豆淀粉，显著降低了调控脂肪存储吸收功能CD36基因转录表达量，显著升高了脂肪氧化酶CPT1B和ACADM转录表达量(P＜0.05)，提高了磷脂合成途径相关酶AGPAT4和GPAT转录表达量(P＜0.05)，以及脂肪结合转运蛋白FABP1的表达量(P＜0.05)。结果表明，长期饲喂生土豆淀粉，在转录层面，降低了肝脏脂肪酸的吸收、储存和合成能力，提高了肝脏脂肪酸的β氧化和磷脂生成能力，降低了肝脏炎症风险，对肝脏代谢调节有益处。
　　4.生土豆淀粉日粮对猪肝脏代谢组谱的影响
　　本试验运用代谢组学分析代谢产物的变化，旨在探究抗性淀粉对肝脏代谢通路的影响。试验设计同试验一，屠宰后，采集肝脏组织，运用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)对肝脏代谢产物进行测定，对差异代谢产物进行筛选，并对代谢通路变化进行分析。结果显示:试验共检测到91种物质，按照筛选标准(VIP＞1，P＜0.05)，筛选出20种作为潜在标记物的差异化合物。其中，生土豆淀粉显著降低了肝脏胆固醇和软脂酸的含量，升高了脂肪酸β氧化程度标记物3-羟基丁酸的含量(P＜0.05)，显著升高了2-酮戊二酸和6-磷酸葡萄糖的含量(P＜0.05)，降低了丙酮酸的含量(P＜0.05)。代谢通路富集分析显示，长期饲喂生土豆淀粉显著抑制了脂肪代谢、甘油磷脂代谢、糖异生、丙酮酸代谢以及胰岛素信号等通路，激活了糖酵解、磷酸戊糖途径、尿素循环、TCA和氨基酸代谢等通路。上述结果表明，长期饲喂生土豆淀粉，会降低肝脏脂肪积累，增加脂肪酸氧化，激活TCA循环和磷酸化途径，有效调节肝脏健康。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照

前言

文献综述

1 抗性淀粉概述

1．1 抗性淀粉的定义

1．2 抗性淀粉的分类和结构

2 抗性淀粉对肠道的影响

2．1 对肠道结构的影响

2．2 对肠道菌群的影响

2．3 对后肠代谢产物的影响

2．4 对后肠健康的影响

3 抗性淀粉对机体代谢影响

3．1 对能量代谢和生长性能的影响

3．2 对血糖调节的影响

3．3 对胃肠激素的影响

3．4 对脂类代谢的影响

4 抗性淀粉与绿色养殖

5 创新点和技术路线

参考文献

试验一 生土豆淀粉日粮对猪结肠微生物结构的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验设计

1．3 样品采集

1．4 肠道菌群分析

1．5 pH测定

1．6 数据处理

2 结果和分析

2．1 测序结果和菌群多样性

2．2 长期饲喂生土豆淀粉对结肠菌群门、属和OUT水平相对丰度的影响

3 讨论

4 小结

参考文献

试验二 生土豆淀粉日粮对猪结肠黏膜转录表达谱的影响

1 材料与方法

1．1 试验设计

1．2 样品采集

1．3 RNA制备

1．4 微矩阵杂交

1．5 差异基因信息学分析

1．6 数据处理

2 结果分析

2．1 基因测序结果

2．2 基因功能GO分析

2．3 差异基因通路富集分析

3 讨论

4 小结

参考文献

试验三 生土豆淀粉日粮对猪肝脏组织转录表达谱的影响

1 材料与方法

1．1 试验设计

1．2 样品采集

1．3 基因芯片处理和分析

1．4 RNA反转录cDNA

1．5 荧光定量PCR引物序列

1．6 荧光定量PCR反应体系

1．7 数据处理

2 试验结果

2．1 肝脏组织转录情况

2．2 基因功能GO分析和基因通路富集分析

2．3 荧光定量PCR验证肝脏转录组

3 讨论

4 小结

参考文献

试验四 生土豆淀粉日粮对猪肝脏代谢组谱的影响

1 材料与方法

1．1 试验设计

1．2 试验试剂

1．3 样品采集

1．4 基于GC-MS肝脏代谢产物测定

1．5 血清生化指标测定

1．6 数据处理

2 结果和分析

2．1 代谢筛选模型的建立

2．2 肝脏代谢物的鉴定

2．3 生土豆淀粉对肝脏代谢通路的影响

2．4 生土豆淀粉对血清代谢产物影响

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢

附录