拟轮枝镰孢、黄色镰孢、雪松疫霉、栗黑水疫霉及大豆种传病原菌的LAMP检测

摘要

水稻恶苗病是水稻的重要病害，影响水稻的生长发育，目前在我国分布非常广泛，经常造成严重的产量损失。大豆镰孢根腐病是大豆根腐病害，常由一种或多种镰孢菌引起，主要症状表现为大豆根部及茎基部的腐烂，该病害目前已严重影响我国东北及黄淮海等大豆主要产区。雪松疫霉(Phytophthora lateralis Tucker&Mibrath)与栗黑水疫霉[P.cambivora(Petri)Buisman]是我国进境植物检疫性病菌，常引起多种植物的毁灭性病害，造成经济损失。种传病原菌是许多农作物病害的重要传染源。它是作物种子贮藏期的主要隐患，也是苗期和生育期作物病害的主要风险。大豆种子上种传病原菌的快速检测是保障大豆种子质量，从而预防种传病害的首要措施。 为了提高对两种病害病原菌的快速检测水平，并在病菌侵染初期对病害进行诊断，降低经济损失，这项研究基于LAMP（loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增）技术，对引起水稻恶苗病的拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)以及引起大豆镰孢根腐病的黄色镰孢(F.culmorum)建立了可分别特异性检测拟轮枝镰孢和黄色镰孢的两种LAMP技术体系。 以Pgk（3-phosphoglycerate kinase，3-磷酸甘油酸激酶）基因作为靶标，建立了拟轮枝镰孢的LAMP检测体系。反应条件为62℃，70min，扩增前在体系中加入HNB（羟基萘酚蓝），待反应结束后通过肉眼观察颜色变化可直接判定结果（阳性呈天蓝色，阴性为紫色）。该体系的最低检出限为目标菌的100pg·μL-1纯DNA。该体系可以直接对田间发病组织中的病原菌进行检测，应用该技术我们成功且快速地对来自南京和镇江的水稻恶苗病样本进行了病害诊断。 以Cyp51c(the third copy of cytochrome P450lanosterol C-14α-demethylase gene,甾醇14α-脱甲基酶基因第3种拷贝)基因作为靶标，建立了黄色镰孢的LAMP检测体系。反应条件为63℃，60min，扩增前在体系中加入HNB（羟基萘酚蓝），待反应结束后通过肉眼观察颜色变化可直接判定结果（阳性呈天蓝色，阴性为紫色）。该体系的最低检出限为目标菌的100pg·μL-1纯DNA，在土壤中检测目标菌的灵敏度达到10个孢子/0.25g土壤。该体系可以直接对田间发病组织中的病原菌进行检测，应用该技术我们对采集自中国多个地方的大豆疑似病样本中的黄色镰孢进行检测，进而诊断病害。 为了防止我国雪松疫霉与栗黑水疫霉两种疫霉的传入和扩散，对其进行快速、准确的检测是至关重要的。这项研究基于LAMP(loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增)技术，以Ypt1（GTP binding protein，鸟苷酸结合蛋白）基因作为靶标，建立了分别特异性检测雪松疫霉与栗黑水疫霉的LAMP体系—Ypt1-Pl-LAMP和Ypt1-Pc-LAMP。反应条件为62℃，80min，扩增前在体系中加入HNB（羟基萘酚蓝），待反应结束后通过肉眼观察颜色变化可直接判定结果（阳性呈天蓝色，阴性为紫色）。体系的最低检出限为目标菌的100pg·μL-1纯DNA，这为雪松疫霉与栗黑水疫霉的及时检测以及它们所导致的病害提供了新的快速诊断技术。 为了了解黄淮地区大豆种子种传病原菌的情况，应用本实验室前期研发的可分别特异性检测尖镰孢(F.oxysporum)、木贼镰孢(F.equiseti)、层出镰孢(F.proliferatum)、黄色镰孢(F.culmorum)、禾谷镰孢(F.graminearum)、茄腐镰孢(F.solani)、大豆拟茎点种腐病菌（Phomapsis lo ngicolla）、平头炭疽（Colletotrichum truncatum）、胶孢炭疽（C.gloeosporioide）、立枯丝核（Rhizoctonia solani）、大豆炭腐病菌（Macrophomina phaseolina）、冬青丽赤壳（Calonectria ilicicola）和大豆疫霉(Phytophthora sojae)13种大豆主要种传病原菌的13个LAMP检测体系，对黄淮地区的29个大豆主栽品种进行种传病原菌检测。结果表明，供试的29个品种中有20个品种种子样本检测出上述病原菌，携带所检测的13种病原菌中的7种。检出率由高到低依次是平头炭疽、大豆拟茎点种腐病、木贼镰孢、黄色镰孢、尖镰孢、胶孢炭疽和层出镰孢，但不同大豆品种种子携带病原菌的种类及数量有较大差异，其中品种‘漯39001’检出的病原菌多达6种。本研究为大豆种子上种传病原菌检测提供了新的方法，并揭示了黄淮地区大豆种传病原菌的状况，在大豆生产上有较大的应用参考价值。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

第一章大豆种传病原菌的研究现状

1大豆种传病原菌的为害

2常见的大豆种传病原菌

3大豆种传病原菌的检测鉴定方法

第二章环介导等温扩增技术的应用

1应用LAMP检测细菌

2应用LAMP检测病毒

3应用LAMP检测寄生虫

4应用LAMP检测真菌和卵菌

第二部分 研究内容

第一章基于环介导等温扩增技术快速诊断由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

第二章基于环介导等温扩增技术快速诊断由黄色镰孢引起的大豆镰孢根腐病

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

第三章环介导等温扩增技术快速检测两种疫霉

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

第四章黄淮地区大豆主栽品种种子上种传病原菌的LAMP检测

1材料与方法

2结果与分析

3结论与讨论

参考文献

附录

攻读硕士期间发表的论文及专利

致谢