沼液及施用沼液土壤中抗生素和抗生素抗性基因的污染特征研究

摘要

目前，抗生素被广泛地添加到动物饲料中，以促进动物生长和治疗动物疾病。由于大部分的抗生素不能被动物体完全吸收同化，30％～90％的抗生素会被排出体外。抗生素可诱导环境中的抗生素抗性基因(ARGs)，ARGs目前被认为是一项重大的环境卫生问题。沼液因含有丰富的营养物质，被广泛用于农业生产中。沼液同时含有某些有毒有害物质，直接施用势必会对环境造成一定的危害性。研究报道表明，在沼液中检测到多种抗生素。较少有研究报道关注沼液中抗性基因ARGs的污染风险问题。 本研究选取13种典型抗生素(氧氟沙星(FOL)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、诺氟沙星(NOR)、盐酸土霉素(OTC)，盐酸四环素(TC)，盐酸金霉素(CTC)，磺胺嘧啶(SDZ)，磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺二甲基嘧啶(SDMD)、磺胺异恶唑(SMX)、磺胺吡啶(SPD))和11种典型ARGs(tetA、tetB、tetC、tetE、tetM、tetW、sul1、sul2、sulA、gryA、qnrB)作为研究目标，开发了沼液中典型抗生素及抗性基因ARGs的检测方法，探讨了不同发酵原料（猪粪、牛粪、鸡粪）沼液中典型抗生素残留情况、微生物群落结构和ARGs丰度。通过室内培养，探完了施用沼液后红壤和潮土中抗生素及ARGs的污染特征，揭示了土壤中抗生素、ARGs与土壤理化性质、暴露时间的相关性等，以期为沼液农用风险评价提供依据。研究结果如下: 1.建立了沼液中13种典型抗生素及11种ARGs的检测方法 通过对流动相配比、柱温、样品pH等进行优化，开发建立了SPE-HPLC检测抗生素方法3种四环素类(TCs)、6种磺胺类(SAs)和4种喹诺酮类(FQs)抗生素在浓度范围内呈现良好线性关系，相关系数均大于0.990，平均回收率为80.4％～105.7％，相对标准偏为1.0％～5.1％，方法的检出限在2.8ug/L～21.0ug/L。11种典型ARGs的丰度测定:利用基因克隆法构建标准质粒，qRT-PCR检测ARGs。 2.探讨不同发酵原料沼液中抗生素和ARGs的含量以及微生物群落结构。 (1)对南京市以猪粪为发酵原料的沼液样品(P1、P2);以牛粪为发酵原料的沼液样品(C1、C2)以鸡粪为发酵原料的沼液样品(CH1、CH2)中的13种抗生素检测结果表明，CH1和CH2中抗生素被检出种类和总浓度最高，其中SMX和NOR的残留含量最高，分别为133.76ug/L和204.83ug/L。 (2)P1、P2、C1、C2细菌数目范围在1.10×1010copies/mL～5.97×1010copies/mL，CH1、CH2细菌数目约在1.06×109copies/mL～5.28×109copies/mL。11种ARGs在不同沼液样本中的检出率均为100％，C2中11种ARGs的绝对丰度总量最高，CH1最低。CH2中11种ARGs的相对丰度总量最高，C1中最低。 (3)沼液中残留抗生素含量与ARGs有一定的相关性，tetB、tetC的绝对丰度与CTC含量有正相关性;sul1与SDMD、SPD有正相关性;suIA与SDZ有显著负相关性(p＜0.05);sul1绝对丰度与SMR含量呈极显著负相关性(p＜0.01）;gryA、qnrB的相对丰度与CIP含量有正相关。 (4)在门水平下沼液中微生物群落结构存在一定差异性。在P1、P2、C1、C2中，Proteobacteria所占比例最高，其次为Bacteroidetes;CH1、CH2中Bacteroidetesa所占比例最高，其次为Firmicutes。 3.研究了施用沼液的红壤、潮土中抗生素与ARGs随暴露时间的变化状况，以及与土壤理化性质的相关性。 (1)沼液中抗生素含量随着时间的变化较小。在潮土中，8种抗生素(TC、OTC、SDZ、SMR、SMX、ENR、FOL、NOR)含量、11种ARGs的绝对丰度与7d、14d、21d的暴露时间有较大相关性，而与28d、42d的暴露时间相关性较小。而在红壤中、tetM、tetW、sul1的绝对丰度与28d暴露时间的相关性较大。 (2)在暴露时间42d时，土壤pH、OM、CEC与SMR、SMZ残留含量呈极显著正相关性，R2均达到0.97以上。土壤pH、OM、C/N、CEC与sul1的绝对丰度呈极显著负相关性，R2范围在-0.939～-906。sul1、sul2的绝对丰度与SMR残留含量呈极显著负相关性，R2范围在-0.965～-817。

目录

声明

论文说明

摘要

图表清单

主要缩短语

第一章文献综述

1．1沼液的利用现状与风险

1．2抗生素和ARGs概论

1．2．1抗生素和ARGs的类型

1．2．2抗生素利用现状、来源、归趋

1．2．3 ARGs的来源与传播

1．3．1水环境中的抗生素的研究现状

1．3．2土壤环境中的抗生素的研究现状

1．3．3抗生素的危害

1．4．1水环境中的ARGs的研究现状

1．4．2土壤环境中的ARGs的研究现状

1．4．3抗生素和ARGs的危害

1．5抗生素及ARGs的检测方法

1．5．1抗生素的检测方法

1．5．2 ARGs的检测技术

1．6．1研究目标及意义

1．6．2研究内容与技术路线

第二章沼液中典型抗生素检测方法的建立

引言

2．1．1材料和方法

2．1．2结果与讨论

2．2固相萃取-高效液相色谱同时测定沼液中3种TCs和6种SAs

引言

2．2．1实验部分

2．2．2样品的采集与准备

2．2．3高效液相色谱检测条件

2．2．4结果与讨论

本章小结

第三章不同发酵原料沼液的微生物群落结构以及抗生素抗性基因测定

引言

3．1材料与方法

3．1．1沼液样品采集

3．1．2沼液中13种抗生素的测定

3．1．3沼液DNA的提取与ARGs片段的扩增以及标准质粒的制备

3．1．4沼液中微生物群落结构的测定

3．1．5数据处理与统计分析

3．2结果与分析

3．2．1标准质粒的构建

3．2．2沼液样本中抗生素的残留情况

3．2．3沼液样本中细菌数目及ARGs丰度

3．2．4沼液中抗生素残留与ARGs的绝对丰度之间的相关性分析

3．2．5沼液中微生物群落结构的变化

3．3讨论

本章小结

第四章施用沼液的红壤和潮土中抗生素及ARGs的污染特征

引言

4．1材料与方法

4．1．1土壤的采集

4．1．2土壤抗生素含量测定

4．1．3土壤DNA的提取

4．1．4土壤ARGs的测定参考第三章

4．2结果与分析

4．2．1土壤中抗生素含量随暴露时间变化的情况

4．2．2土壤中ARGs随暴露时间变化的趋势

4．2．3土壤性质与抗生素残留及ARGs的关系

4．2．4土壤中抗生素含量、ARGs绝对丰度与暴露时间变化的关系

4．3讨论

本章小结

全文总结

主要创新点

不足之处

研究展望

参考文献

硕士在读期间发表论文

致谢