桑树秋末冬初绿枝扦插生根的理化与转录组分析及鉴定

摘要

桑树具有顽强的生命力和适应性,生命期长,容易成林,不仅可绿化环境,防风固沙,涵养水源,净化空气,收到良好的生态效应,还可以取得较高的经济效益。通过对桑树扦插生理学和转录组学的研究为桑苗快速繁育技术的创新提供理论支撑,加快优良桑树品种的推广应用,对提高桑园的质量和产量具有重要的意义。
　　通过对秋末冬初桑树绿枝扦插进行相关生理生化指标分析桑树扦插生根的生理机理;利用Solexa高通量测序构建了秋末冬初桑树绿枝扦插生根过程中的4个转录组数据库,通过分析大量的测序结果,筛选出相当多差异表达的基因,揭示了生根过程中转录组水平的复杂的调控网络。并对在扦插生根过程中显著差异表达的基因MaGH3.6的进行基因的克隆、表达模式的分析、系统发生分析和功能验证。
　　主要实验结果和结论如下:
　　1.可溶性糖和可溶性蛋白的含量在扦插生根过程总的趋势是处于下降的趋势,但在扦插后期,可溶性糖的含量逐步回升。在扦插前期,IAAO(吲哚乙酸氧化酶)的活性先显著上升后下降,中期活性变化不显著,后期吲哚乙酸氧化酶活性逐渐上升并维持在较高活性水平。POD(过氧化物酶)呈现前期先逐步上升后下降,中期变化不大,后期先上升下降的趋势。PPO(多酚氧化酶)的活性在整个扦插过程中,呈现“U”型变化。
　　2.通过Solexa高通量测序,构建了4个转录组数据库:S1,S2,S3和S4。所得的原始序列经过去除低质量区域、denovo拼接,分别得到69058,69087,66557和66556个contig(序列片段)。对所得contig与UniProt蛋白数据库进行blastx比对,进行蛋白功能注释,4个数据库分别有39504(57.20％),39497(57.17%),31868(57.17%)和23837(35.81%)有明确的蛋白功能注释。为了解各个发育阶段之间的差异基因表达情况,根据基因的表达量RPKM值对contig进行筛选,共获得332(S1vs.S2),6381(S2vs.S3)和842(S3vs.S4)个差异基因,并对获得差异基因进行GO和KEGG功能富集。根据差异基因和GO和KEGG功能富集,详细比较了每个发育阶段之间的差异表达基因,结果表明:差异明显的基因主要可分为:碳代谢和能量代谢,植物激素信号转导,细胞分化、增值和细胞周期等3类。为验证测序数据库的有效性,随机选取9个基因进行qRT-PCR(荧光实时相对定量PCR)验证,结果表明数据库数据与qRT-PCR结果基本一致,测序构建的cDNA文库数据准确有效。
　　3.从桑树茎部皮层克隆了一个桑树GH3(gretchen hagen3)基因,并将其命名为MaGH3.6(GenBank登录号:KC349982)。生物信息学分析显示该基因编码611个氨基酸残基,蛋白质分子质量为68.87kD,无跨膜区域和信号肽序列,而且蛋白质序列相当保守。半木质化和木质化的桑树插穗经NAA(萘乙酸)和IAA(吲哚-3-乙酸)诱导处理后,通过荧光实时定量PCR检测到插穗皮层MaGH3.6的表达水平在0.5h内急剧增加,并随着时间延长呈逐渐增高趋势,其中NAA诱导处理组MaGH3.6的表达量明显高于IAA诱导处理组。利用Solexa mRNA测序构建的cDNA文库数据分析表明,MaGH3.6在桑树扦插后期根原基和根状突起形成阶段的表达量显著下降。研究结果提示MaGH3.6可由IAA和NAA诱导上调表达,推测该基因的表达量下降可能会引起IAA的含量增加,继而促进插穗不定根的形成和发育,初步认为该基因在桑树扦插生根过程中扮演重要的角色。

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摘 要

英文摘要

目 录

第一章 绪 论

1.1 研究背景

1.2研究的目的与意义

1.3 研究内容

第二章 桑树秋末冬初绿枝扦插生根生理生化指标的测定

2.1 材料制作及主要试剂

2.2实验方法

2.3结果与分析

2.4讨论

第三章 桑树秋末冬初绿枝扦插转录组测序分析

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3 结果及分析

3.4讨论

第四章 桑树MaGH3.6基因的克隆与诱导表达及时间特异性

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.3讨论

结 论

参考文献

攻读硕士期间发表的论文

致谢